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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核表达引物设计问题
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dewdan

新虫 (初入文坛)

[求助] 原核表达引物设计问题

我做原核表达的，设计引物时上下游引物GC含量只有40、43℃，退火温度62左右，但是P不出条带来，是因为引物GC含量低了吗
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1楼 2013-07-04 20:17:06
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武穆大成

木虫 (著名写手)

笨蛋

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
dewdan(myprayer代发): 金币+1, Gifts of roses, there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-07-04 22:23:40
p不出来的原因有很多种，引物，模板，酶，都有可能会影响。。建议做对照。。引物用oligo。primer等软件分析下。。
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2楼2013-07-04 21:35:11
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, Gifts of roses, there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-07-05 08:21:14
GC含量不是特别高或者特别低的话应该都比较好P的。P不出来可能有很多原因，你可以先试试优化一下退火温度。
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3楼2013-07-05 00:43:21
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dewdan

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-05 00:43:21
GC含量不是特别高或者特别低的话应该都比较好P的。P不出来可能有很多原因，你可以先试试优化一下退火温度。

我试了从52到70℃的四个退火温度，用rtaq酶p感觉都有条带出来了，但是用高保真酶P就没了。。。
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4楼2013-07-05 10:23:47
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lillian菲

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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gyesang: 金币+3, 鼓励回帖应助！ 2013-07-05 15:06:29
你好，引物GC含量影响不是特别的大，在40-60%之间即可。主要是退火温度，一般设计的理论值比实际操作还要再低5度。也就是说，你设计的是62度，实际实验时只需设置57度即可
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5楼2013-07-05 10:55:01
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by dewdan at 2013-07-05 10:23:47
我试了从52到70℃的四个退火温度，用rtaq酶p感觉都有条带出来了，但是用高保真酶P就没了。。。...

不同的酶的最优反应条件可能会不同。需要分别优化。
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6楼2013-07-05 15:59:13
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zc10052157

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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你用的模板是质粒吗？
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hold住
7楼2013-07-05 20:37:15
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