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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 毕赤酵母电转
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皇马铁卫

铜虫 (正式写手)

[求助] 毕赤酵母电转

做了很久毕赤酵母GS115的电转化。转的是DNA片段，双交换敲除基因。
转化方法用的是Wu S, Letchworth G J. High efficiency transformation by electroporation of pichia pastoris pretreated with lithium acetate and dithiothreitol[J]. Biotechniques, 2004, 36(1): 152-155
1. 50mlYPD摇菌至OD 1.5~2.0
2. 收集菌体。每10ml作一管收集，即为一个感受态
3. 每管以8 mL LDST（ 100 mM LiAc, 10 mM DTT,0.6 M sorbitol, and 10 mM Tris-HCl,    pH 7.5）室温处理30min
4. 4℃离心。以1ml预冷的1M 山梨醇洗三次
5. 最后以80微升预冷的1M 山梨醇重悬。感受态浓度约为10^10个细胞/mL
电转条件1500V，25μF，200Ω（这个条件的电转仪要去别的实验室借用，本实验有的电转仪是1500V，36μF,186Ω，两种条件都用过）。2mm电击杯。
DNA量10~100ng，溶于5~10μL水中。混合后冰浴5min。（电转仪预热，电击杯预冷）。电击后迅速加入1ml 预冷的1M 山梨醇。30℃孵育1.5h。然后加入1mlYPD，150rpm摇2~3h。取200μL涂板（YPD含1M山梨醇，300μg/ml G418）

每次结果都是长3~4天无明显克隆。5~6天时长满背景克隆（有挑出验证过，都是假阳性）。阴性对照基本不长的。前后做了几十次了。就得到2个阳性克隆。有很多时候，能长出几个克隆。重新划线于G418平板上，仍然可以长，但是提基因组PCR验证都不对。
做的都快吐了求虫友们给点意见！

[ Last edited by 皇马铁卫 on 2013-7-3 at 15:45 ]
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春晓赏花，夏日听蝉，箫吹秋月，酒饮冬霜~
1楼 2013-07-03 15:42:11
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infrared123
2楼2013-07-03 15:53:44
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lwiaanngg

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 回答很好，perfect 2013-07-04 17:27:14
皇马铁卫: 金币+2, ★有帮助, 我转化的是DNA片段，不存在ligation的问题哦 2013-07-06 15:46:13
1. 你这个问题比较复杂，从描述上看，你的ligation做的如何呢？如果你的ligation效果不好，即使你的电转效率再高，你拿到都是背景克隆。如果你的plasmid是transfer vector，可以考虑先用e.coli做完ligation，等提出很好的positive plasmid后再转入酵母中。
2. 个人建议你做competent cell时用瓶子而不是管子，呵呵
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3楼2013-07-04 17:10:43
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ericyo918

至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
皇马铁卫: 金币+2 2013-07-10 09:07:22
试试钙转，一个方法不行换另外一个，呵呵。
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4楼2013-07-04 17:44:48
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带刺毛毛虫

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 完全认同 2013-07-05 16:11:37
皇马铁卫: 金币+2, z这个问题帖子中提到的 2013-07-06 15:47:01
好像你的DNA量太少了吧，还有你电击后要立即马上加上山梨醇悬起来，要求非常快的。
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加油
5楼2013-07-05 10:10:03
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hj890509

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
皇马铁卫: 金币+2 2013-07-10 09:07:32
DNA量应该5~10ug，另外电转2mm的电压应该是2500v
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6楼2013-07-05 15:50:42
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84146922

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
皇马铁卫: 金币+10, 你说的问题我都注意过的，还是感谢下 2013-07-06 15:40:36
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-07-07 17:31:21
1.DNA是线性化后吗？线性化后必须PCR纯化，离子对电转的效率影响很大
2.电压电阻我觉得没有问题，因为我们实验室也是一样的。
3.你使用G418抗性，那应该是9K载体吧，可以试试使用MD平板，我们在使用zeocin抗性YPD平板时，只是30℃孵育1.5h，直接涂布了。后面并没有加入YPD等步骤。
4.如果3-4天都没有克隆，那就不会有阳性克隆了（实验室经验）。
5.我们实验室是50mlYPD摇菌至OD 1.5~2.0，直接离心，去上清，加入40mlLDST（现配），30摄氏度孵育30min。LDST一定要现配，里面有DTT......不知道是不是这些问题
6.电击杯是正常的吗？？之前使用有木有问题...
暂时看到这些问题....希望能帮助你
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7楼2013-07-05 17:18:27
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84146922

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 感谢应助！ 2013-07-07 17:31:57
对了，这有篇文章，可以参考...
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    • 2013-07-05 17:26:06, 166.4 K
8楼2013-07-05 17:20:04
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皇马铁卫

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 84146922 at 2013-07-05 17:20:04
对了，这有篇文章，可以参考...

这篇文章就是我帖子中提到的文献
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春晓赏花，夏日听蝉，箫吹秋月，酒饮冬霜~
9楼2013-07-06 15:36:24
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皇马铁卫

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lwiaanngg at 2013-07-04 17:10:43
1. 你这个问题比较复杂，从描述上看，你的ligation做的如何呢？如果你的ligation效果不好，即使你的电转效率再高，你拿到都是背景克隆。如果你的plasmid是transfer vector，可以考虑先用e.coli做完ligation，等提出 ...

转的是DNA片段啊，不存在连接的问题
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春晓赏花，夏日听蝉，箫吹秋月，酒饮冬霜~
10楼2013-07-06 15:37:16
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