| 查看: 3570 | 回复: 17 | ||||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||||
[求助]
毕赤酵母电转
|
||||
|
做了很久毕赤酵母GS115的电转化。转的是DNA片段，双交换敲除基因。 转化方法用的是Wu S, Letchworth G J. High efficiency transformation by electroporation of pichia pastoris pretreated with lithium acetate and dithiothreitol[J]. Biotechniques, 2004, 36(1): 152-155 1. 50mlYPD摇菌至OD 1.5~2.0 2. 收集菌体。每10ml作一管收集，即为一个感受态 3. 每管以8 mL LDST（ 100 mM LiAc, 10 mM DTT,0.6 M sorbitol, and 10 mM Tris-HCl, pH 7.5）室温处理30min 4. 4℃离心。以1ml预冷的1M 山梨醇洗三次 5. 最后以80微升预冷的1M 山梨醇重悬。感受态浓度约为10^10个细胞/mL 电转条件1500V，25μF，200Ω（这个条件的电转仪要去别的实验室借用，本实验有的电转仪是1500V，36μF,186Ω，两种条件都用过）。2mm电击杯。 DNA量10~100ng，溶于5~10μL水中。混合后冰浴5min。（电转仪预热，电击杯预冷）。电击后迅速加入1ml 预冷的1M 山梨醇。30℃孵育1.5h。然后加入1mlYPD，150rpm摇2~3h。取200μL涂板（YPD含1M山梨醇，300μg/ml G418） 每次结果都是长3~4天无明显克隆。5~6天时长满背景克隆（有挑出验证过，都是假阳性）。阴性对照基本不长的。前后做了几十次了。就得到2个阳性克隆。有很多时候，能长出几个克隆。重新划线于G418平板上，仍然可以长，但是提基因组PCR验证都不对。 做的都快吐了  求虫友们给点意见！[ Last edited by 皇马铁卫 on 2013-7-3 at 15:45 ] |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 分子生化实验经验积累 | 蛋白表达纯化鉴定精华 |
» 猜你喜欢
含氟糖皮质激素的外用抗炎利器醋酸氟轻松
已经有0人回复
-
阿莫奈韦（Amenamevir）：解旋酶-引物酶靶向分子的结构特征与合成路径全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有198人回复
-
利瑞鲁单抗：靶向KIR的NK细胞检查点工具抗体，结构基础与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 毕赤酵母电转时质粒浓度到底多少最合适？？
已经有10人回复
- 毕赤酵母用于电转化制备感受态细胞步骤
已经有13人回复
- 毕赤酵母电转请教
已经有6人回复
- 毕赤酵母电转化问题求助
已经有26人回复
- 毕赤酵母表达一直不表达
已经有13人回复
- 求助关于毕赤酵母电转抗性的问题
已经有5人回复
- 毕赤酵母X-33如何活化以及感受态制备
已经有12人回复
- 关于毕赤酵母电转化
已经有10人回复
- 关于毕赤酵母gs115可否用转化化学转化
已经有6人回复
- 毕赤酵母表达出蛋白但没有活性
已经有18人回复
- 毕赤酵母表达的蛋白无活性
已经有8人回复
- 求助：毕赤酵母电转化
已经有5人回复
- 求助毕赤酵母电转化问题
已经有6人回复
- 【求助/交流】关于毕赤酵母电转化
已经有22人回复
- 【求助/交流】求助毕赤酵母电转化
已经有4人回复
- 【求助/交流】GS115在MGY液体培养基内不生长
已经有6人回复
- 【求助/交流】关于毕赤酵母电转后PCR验证问题
已经有20人回复
- 【求助/交流】毕赤酵母电转化问题
已经有5人回复
- 电转化注意事项
已经有14人回复
- 毕赤酵母表达（总是整合不上）
已经有17人回复
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
皇马铁卫: 金币+10, 你说的问题我都注意过的，还是感谢下 2013-07-06 15:40:36
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-07-07 17:31:21
感谢参与，应助指数 +1
皇马铁卫: 金币+10, 你说的问题我都注意过的，还是感谢下 2013-07-06 15:40:36
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-07-07 17:31:21
|
1.DNA是线性化后吗？线性化后必须PCR纯化，离子对电转的效率影响很大 2.电压电阻我觉得没有问题，因为我们实验室也是一样的。 3.你使用G418抗性，那应该是9K载体吧，可以试试使用MD平板，我们在使用zeocin抗性YPD平板时，只是30℃孵育1.5h，直接涂布了。后面并没有加入YPD等步骤。 4.如果3-4天都没有克隆，那就不会有阳性克隆了（实验室经验）。 5.我们实验室是50mlYPD摇菌至OD 1.5~2.0，直接离心，去上清，加入40mlLDST（现配），30摄氏度孵育30min。LDST一定要现配，里面有DTT......不知道是不是这些问题 6.电击杯是正常的吗？？之前使用有木有问题... 暂时看到这些问题....希望能帮助你 |
7楼2013-07-05 17:18:27
lwiaanngg
铁杆木虫 (著名写手)
- 应助: 46 (小学生)
- 贵宾: 0.773
- 金币: 7403.2
- 散金: 24
- 红花: 12
- 帖子: 1211
- 在线: 110.3小时
- 虫号: 43541
- 注册: 2004-04-10
- 专业: 应用高分子化学与物理
【答案】应助回帖
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 回答很好，perfect 2013-07-04 17:27:14
皇马铁卫: 金币+2, ★有帮助, 我转化的是DNA片段，不存在ligation的问题哦 2013-07-06 15:46:13
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 回答很好，perfect 2013-07-04 17:27:14
皇马铁卫: 金币+2, ★有帮助, 我转化的是DNA片段，不存在ligation的问题哦 2013-07-06 15:46:13
|
1. 你这个问题比较复杂，从描述上看，你的ligation做的如何呢？如果你的ligation效果不好，即使你的电转效率再高，你拿到都是背景克隆。如果你的plasmid是transfer vector，可以考虑先用e.coli做完ligation，等提出很好的positive plasmid后再转入酵母中。 2. 个人建议你做competent cell时用瓶子而不是管子，呵呵 |
3楼2013-07-04 17:10:43
ericyo918
至尊木虫 (知名作家)
- 应助: 156 (高中生)
- 金币: 15157.4
- 散金: 846
- 红花: 20
- 帖子: 5085
- 在线: 1447.8小时
- 虫号: 1808878
- 注册: 2012-05-10
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
4楼2013-07-04 17:44:48
5楼2013-07-05 10:10:03
