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1楼 2013-07-01 20:26:49

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wxianzhen

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
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注册: 2011-06-04
专业: 微生物生理与生物化学

【答案】应助回帖

6.0% Urea-PAGE的制备及电泳
1. 试剂配制
A．5xTBE
Tris-base
EDTA
硼酸
用ddH2O定容至

B. 6.0% Urea-PAGE
Urea
5xTBE
Acrylamide (丙烯酰胺)
N,N-Methylene Bissacrylamide (甲叉丙烯酰胺)
用ddH2O定容至
注意：尿素溶于水是吸热反应
待完全溶解后过滤，将过滤好的Urea-PAGE溶液置于4℃条件下保存

C. 10AP (过硫酸铵)
过硫酸铵(AP)
加ddH2O定容至

D. 10mg/ml硫代硫酸钠
Na2S2O3.5H2O
加蒸馏水定容至

E. 粘合剂
无水乙醇
醋酸
粘合剂（6514）

F. 10% 醋酸（固定液）：100ml醋酸加ddH2O定容至

G. 染色液
硝酸银1.2-1.5g溶于1L ddH2O中，再加37%甲醛1.5ml-20ml。或0.2%硝酸银：2g硝酸银，加入1L ddH2O混匀后避光室温保存。

F. 显影液（使用前1-2天配制，效果最佳）
25-30g碳酸钠溶于1L ddH2O中，加10mg/ml硫代硫酸钠200μl，37%甲醛1.5ml-2.0ml，混匀即可。
或：100g无水碳酸钠
2ml甲醛
160μl 50mg/ml硫代硫酸钠
或800μl 10mg/ml硫代硫酸钠
H. 50 x Loading Buffer
甲酰胺
二甲苯青
溴酚蓝
1 x Loading Buffer（用于加到扩增产物中）
2ml 50 x Loading Buffer加上2ml 0.5M/L EDTA，再用甲酰胺稀释至100ml。

I. 2 x Loading dye (用于变性胶；98%甲酰胺，10mM EDTA，0.05%溴酚蓝，0.05%二甲苯青) 4℃条件下保存
甲酰胺
EDTA
溴酚蓝
二甲苯青

J. 3 x Loading dye (用于变性胶；95%甲酰胺，10mM NaOH，0.05%溴酚蓝，0.05%二甲苯青) 4℃条件下保存
甲酰胺
NaOH
溴酚蓝
二甲苯青

二. 电泳
A. 制60ml 6% Urea-PAGE
6% Urea-PAGE
10% AP
TEMED
混合均匀后冰浴待用

B. 预电泳
电泳液：1 x TBE
电压：180V
时间：2h

C. 上样
10μl PCR产物，加10μl Loading Buffer在95℃下变性5min，之后冰浴使其冷却至4℃，吸取5μl混合液上样

D.电泳
电压：180v
时间：90min

E. 银染：
10%冰乙酸

ddH2O

0.2%硝酸银

ddH2O

显影液

具体数字没写！你自己查吧，我今天刚刚写出来的。也做SSR，变性PAGE。直接把玻璃板搞碎2快

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回复此楼

2楼2014-01-13 17:26:44

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