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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR的问题，痛苦！
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liyongliangx

铜虫 (小有名气)

[求助] PCR的问题，痛苦！

做了一个PCR ，结果如图：10ul的体系，酶用的Phusion mix,加样5ul ，引物 20uM 0.2ul，模板1ng/ul 0.2ul,ddH2O补至10 ul。
反应条件是退火60度，延伸72 1min。  
要扩增的片段大小为2000bp。
引物为别人文献里报道的，
用了PRIMER 5.0  分析结果也在附件中，我问过了原作者，他告诉我他们扩增的没有问题。但是不知道我这哪里出了问题。作者告诉我他们用50-55退火温度都可以 ，但我做了后全是弥散带，做了梯度后发现最好就是这样了，再高的温度就没有带了。。。
希望大家帮我分析分析。
先进的同学帮助下后进的同学。
PCR的问题，痛苦！
1.png


PCR的问题，痛苦！-1
85000F2C9B404366A35CD7F31F7F1EC9.jpg

[ Last edited by 1949stone on 2013-7-1 at 07:46 ]
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1楼 2013-06-30 19:42:51
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

animbiotech

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
1949stone: 金币+1, 现在酶的质量一般都很好了 2013-07-01 07:47:30
建议换另外一家Taq酶
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4楼2013-06-30 22:25:59
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m_marion

新虫 (小有名气)
★
1949stone: 金币+1, 有钱有的时候也不是好事啊 要看自身需要 最好问问楼主使用来做啥的 2013-07-01 07:48:33
引用回帖:
4楼: Originally posted by animbiotech at 2013-06-30 22:25:59
建议换另外一家Taq酶

开什么玩笑？Phusion是高保真酶，要换也是换别的高保真酶，换Taq是嫌测序经费花不掉么？
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5楼2013-06-30 23:26:57
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m_marion

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
liyongliangx: 金币+1, ★有帮助, 给我指明了思想上的问题 2013-07-01 15:04:00
引用回帖:
2楼: Originally posted by liyongliangx at 2013-06-30 19:55:06
作者告诉我他们用50-55退火温度都可以 ，但我做了后全是弥散带，做了梯度后发现最好就是这样了，再高的温度就没有带了。。

亮带位置对就行了，不爽就电泳纯化一下，一般直接用都没问题。

我做Touch-down PCR有时也搞成这样，从来没有觉得有啥大不了的。
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6楼2013-06-30 23:30:06
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董文华

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
1949stone: 金币+1, 追求完美 精益求精 2013-07-01 07:49:21
既然有一条带了，可能是引物的问题，，，也许这就是结果！！！能做分析不就行了，，干嘛做那么多，，还非得跟原作一样，真没必要！！！
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不要在该奋斗的年纪里，想太多而迟迟不动手。
7楼2013-07-01 00:31:15
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普通回帖

liyongliangx

铜虫 (小有名气)
作者告诉我他们用50-55退火温度都可以 ，但我做了后全是弥散带，做了梯度后发现最好就是这样了，再高的温度就没有带了。。
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2楼2013-06-30 19:55:06
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透明的玻璃杯

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
1949stone: 金币+2, 不错 2013-07-01 07:47:08
亮的是2K吗？
作者告诉我他们用50-55退火温度都可以,反应条件是退火60度. 这一点不清楚，你试过50没有？
引物0.2ul, 有没有试过多加点？
要不再另外找家公司合成新的引物试试，反正也不贵。

我能想到的就是这些，祝好运！
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皇帝诞生地
3楼2013-06-30 20:37:12
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ivyvampire

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这不是引物二聚体，也不是非特异扩增，背景有点高，你模板和引物分别跑过电泳没，可能模板没提纯
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8楼2013-07-01 11:20:13
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zou43118217

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
虽然pfu酶扩增速度快，但建议还是给延伸时间加长，用utrapfu 10分钟可以扩增从1k到10k所有条带
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9楼2013-07-01 12:12:12
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zou43118217

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by zou43118217 at 2013-07-01 12:12:12
虽然pfu酶扩增速度快，但建议还是给延伸时间加长，用utrapfu 10分钟可以扩增从1k到10k所有条带

另外引物TM值太低了，要是用60℃退火，可以把引物TM值设到60~65左右
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10楼2013-07-01 12:14:22
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