应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR的问题，痛苦！
221/3返回列表123下一页
查看: 2280  |  回复: 21
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

liyongliangx

铜虫 (小有名气)

[求助] PCR的问题，痛苦！

做了一个PCR ，结果如图：10ul的体系，酶用的Phusion mix,加样5ul ，引物 20uM 0.2ul，模板1ng/ul 0.2ul,ddH2O补至10 ul。
反应条件是退火60度，延伸72 1min。  
要扩增的片段大小为2000bp。
引物为别人文献里报道的，
用了PRIMER 5.0  分析结果也在附件中，我问过了原作者，他告诉我他们扩增的没有问题。但是不知道我这哪里出了问题。作者告诉我他们用50-55退火温度都可以 ，但我做了后全是弥散带，做了梯度后发现最好就是这样了，再高的温度就没有带了。。。
希望大家帮我分析分析。
先进的同学帮助下后进的同学。
PCR的问题，痛苦！
1.png


PCR的问题，痛苦！-1
85000F2C9B404366A35CD7F31F7F1EC9.jpg

[ Last edited by 1949stone on 2013-7-1 at 07:46 ]
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-06-30 19:42:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

animbiotech

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
1949stone: 金币+1, 现在酶的质量一般都很好了 2013-07-01 07:47:30
建议换另外一家Taq酶
赞一下(2人) 回复此楼
4楼2013-06-30 22:25:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

m_marion

新虫 (小有名气)
★
1949stone: 金币+1, 有钱有的时候也不是好事啊 要看自身需要 最好问问楼主使用来做啥的 2013-07-01 07:48:33
引用回帖:
4楼: Originally posted by animbiotech at 2013-06-30 22:25:59
建议换另外一家Taq酶

开什么玩笑？Phusion是高保真酶，要换也是换别的高保真酶，换Taq是嫌测序经费花不掉么？
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2013-06-30 23:26:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

m_marion

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
liyongliangx: 金币+1, ★有帮助, 给我指明了思想上的问题 2013-07-01 15:04:00
引用回帖:
2楼: Originally posted by liyongliangx at 2013-06-30 19:55:06
作者告诉我他们用50-55退火温度都可以 ，但我做了后全是弥散带，做了梯度后发现最好就是这样了，再高的温度就没有带了。。

亮带位置对就行了，不爽就电泳纯化一下，一般直接用都没问题。

我做Touch-down PCR有时也搞成这样，从来没有觉得有啥大不了的。
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2013-06-30 23:30:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

董文华

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
1949stone: 金币+1, 追求完美 精益求精 2013-07-01 07:49:21
既然有一条带了，可能是引物的问题，，，也许这就是结果！！！能做分析不就行了，，干嘛做那么多，，还非得跟原作一样，真没必要！！！
赞一下(1人) 回复此楼
不要在该奋斗的年纪里，想太多而迟迟不动手。
7楼2013-07-01 00:31:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

liyongliangx

铜虫 (小有名气)
作者告诉我他们用50-55退火温度都可以 ，但我做了后全是弥散带，做了梯度后发现最好就是这样了，再高的温度就没有带了。。
赞一下 回复此楼
2楼2013-06-30 19:55:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

透明的玻璃杯

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
1949stone: 金币+2, 不错 2013-07-01 07:47:08
亮的是2K吗？
作者告诉我他们用50-55退火温度都可以,反应条件是退火60度. 这一点不清楚，你试过50没有？
引物0.2ul, 有没有试过多加点？
要不再另外找家公司合成新的引物试试，反正也不贵。

我能想到的就是这些，祝好运！
赞一下 回复此楼
皇帝诞生地
3楼2013-06-30 20:37:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ivyvampire

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这不是引物二聚体，也不是非特异扩增，背景有点高，你模板和引物分别跑过电泳没，可能模板没提纯
赞一下 回复此楼
8楼2013-07-01 11:20:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zou43118217

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
虽然pfu酶扩增速度快，但建议还是给延伸时间加长，用utrapfu 10分钟可以扩增从1k到10k所有条带
赞一下 回复此楼
9楼2013-07-01 12:12:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zou43118217

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by zou43118217 at 2013-07-01 12:12:12
虽然pfu酶扩增速度快，但建议还是给延伸时间加长，用utrapfu 10分钟可以扩增从1k到10k所有条带

另外引物TM值太低了，要是用60℃退火，可以把引物TM值设到60~65左右
赞一下 回复此楼
10楼2013-07-01 12:14:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 liyongliangx 的主题更新
221/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考博] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 4/200 2026-08-30 01:58 by ZPa0EcMwuECS
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +5 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 6/300 2026-08-30 01:58 by ZPa0EcMwuECS
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +4 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 4/200 2026-08-30 01:45 by ZPa0EcMwuECS
[博后之家] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +4 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 6/300 2026-08-30 01:36 by ZPa0EcMwuECS
[考博] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 4/200 2026-08-30 01:34 by ZPa0EcMwuECS
[找工作] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 7/350 2026-08-30 01:14 by ZPa0EcMwuECS
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +6 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 9/450 2026-08-30 01:04 by ZPa0EcMwuECS
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +4 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 5/250 2026-08-30 00:52 by ZPa0EcMwuECS
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +6 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 12/600 2026-08-30 00:31 by ZPa0EcMwuECS
[基金申请] 有没有仍没收到信息的 +5 德尚中行 2026-08-27 6/300 2026-08-29 18:10 by manplx
[基金申请] 系统查不到 +11 董八千 2026-08-26 11/550 2026-08-28 18:06 by Leogzhya
[基金申请] 看板上这么多中的，有点像50人群里49个人都是骗子的那种感觉…… +5 a089 2026-08-26 6/300 2026-08-27 14:05 by jonewore
[基金申请] 怎么看青基中了没有啊 +5 叶九微 2026-08-26 5/250 2026-08-27 10:35 by l_zh2008
[基金申请] 为什么 国际(地区)合作与交流项目 没有放榜？ 10+3 majunge000 2026-08-26 11/550 2026-08-27 08:42 by 北京莱茵编辑
[基金申请] 2026年的国家社科基金项目通讯评审的新规则与新动向、新挑战 +7 process2012 2026-08-23 10/500 2026-08-26 19:23 by hmhminy
[基金申请] 2026年8月25日国自然放榜前突然收到列入评审专家邮件，有关系吗？ +25 木水思豆 2026-08-25 28/1400 2026-08-26 14:53 by draco1987
[基金申请] 为什么国自然不能直接公布 +4 bjdxyxy 2026-08-26 4/200 2026-08-26 13:12 by qingmu1201
[基金申请] 项目信息和经费信息在系统里都可以看到了 +6 wittyboy 2026-08-26 14/700 2026-08-26 10:55 by wittyboy
[基金申请] 在坚冰还盖着北海的时候，我看到了怒放的梅花。 (金币+10) +6 ziyangfang 2026-08-25 9/450 2026-08-25 20:26 by huagongfeihu
[基金申请] 某些机构，以效率低为荣，以效率低作为存在感 +9 yuleib84 2026-08-25 10/500 2026-08-25 17:14 by alexon
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭