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liyongliangx

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 透明的玻璃杯 at 2013-06-30 20:37:12
亮的是2K吗?
作者告诉我他们用50-55退火温度都可以,反应条件是退火60度. 这一点不清楚,你试过50没有?
引物0.2ul, 有没有试过多加点?
要不再另外找家公司合成新的引物试试,反正也不贵。

我能想到的就是这 ...

我从38度到62度都 度过了,只有60 和61会有个亮带。引物到没有试着多加过,其中有什么玄机吗?
11楼2013-07-01 13:25:30
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liyongliangx

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by ivyvampire at 2013-07-01 11:20:13
这不是引物二聚体,也不是非特异扩增,背景有点高,你模板和引物分别跑过电泳没,可能模板没提纯

模板是别人寄给我的,到了之后我就跑了电泳,回收回来的。不知道怎么破了
12楼2013-07-01 13:30:24
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liyongliangx

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
10楼: Originally posted by zou43118217 at 2013-07-01 12:14:22
另外引物TM值太低了,要是用60℃退火,可以把引物TM值设到60~65左右...

退火温度不是我刻意要求的,我做了梯度后,只在60度有条带,悲剧啊
13楼2013-07-01 13:31:45
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liyongliangx

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by ivyvampire at 2013-07-01 11:20:13
这不是引物二聚体,也不是非特异扩增,背景有点高,你模板和引物分别跑过电泳没,可能模板没提纯

我自己电泳回收过,再进一步的提纯方法就不会了
14楼2013-07-01 13:35:38
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liyongliangx

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by zou43118217 at 2013-07-01 12:12:12
虽然pfu酶扩增速度快,但建议还是给延伸时间加长,用utrapfu 10分钟可以扩增从1k到10k所有条带

不是说时间久了 为非特异性扩增吗?
15楼2013-07-01 13:43:14
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ivyvampire

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
12楼: Originally posted by liyongliangx at 2013-07-01 13:30:24
模板是别人寄给我的,到了之后我就跑了电泳,回收回来的。不知道怎么破了...

那可能回收得不好,回收后乙醇没挥发完全也会引起这种现象。这肯定是背景太深了,又不是扩不出来,跟模板,酶,引物质量关系比较大,你回收后跑电泳没,可以看看条带怎么样?
16楼2013-07-01 14:41:44
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liyongliangx

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
16楼: Originally posted by ivyvampire at 2013-07-01 14:41:44
那可能回收得不好,回收后乙醇没挥发完全也会引起这种现象。这肯定是背景太深了,又不是扩不出来,跟模板,酶,引物质量关系比较大,你回收后跑电泳没,可以看看条带怎么样?...

有作过,回收后 条带就是2k 的一条,也没有杂带什么的。我觉得可能是引物特异性不高,准备自己设计一对。重新做做看。
17楼2013-07-01 15:02:17
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zc10052157

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
2000bp只延伸1min吗    2min试试吧
hold住
18楼2013-07-01 16:02:17
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zou43118217

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
15楼: Originally posted by liyongliangx at 2013-07-01 13:43:14
不是说时间久了 为非特异性扩增吗?...

特异性扩增的最主要原因还是引物的特异性不够,就是太短,使得TM值越高,特异性越高,换引物吧,从来没用过TM值这么低的引物,我一般设TM为68℃的引物,而后根据酶选择不同选取适合合适的退火温度,像UtraPF一般就是62℃
19楼2013-07-01 16:57:52
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m_marion

新虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by zou43118217 at 2013-07-01 12:12:12
虽然pfu酶扩增速度快,但建议还是给延伸时间加长,用utrapfu 10分钟可以扩增从1k到10k所有条带

Phusion和PrimeSTAR等高保真酶都有接近TaqE的速度,远远高于pfu
20楼2013-07-01 17:00:22
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