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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR的问题，痛苦！
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liyongliangx

铜虫 (小有名气)

[求助] PCR的问题，痛苦！

做了一个PCR ，结果如图：10ul的体系，酶用的Phusion mix,加样5ul ，引物 20uM 0.2ul，模板1ng/ul 0.2ul,ddH2O补至10 ul。
反应条件是退火60度，延伸72 1min。  
要扩增的片段大小为2000bp。
引物为别人文献里报道的，
用了PRIMER 5.0  分析结果也在附件中，我问过了原作者，他告诉我他们扩增的没有问题。但是不知道我这哪里出了问题。作者告诉我他们用50-55退火温度都可以 ，但我做了后全是弥散带，做了梯度后发现最好就是这样了，再高的温度就没有带了。。。
希望大家帮我分析分析。
先进的同学帮助下后进的同学。
PCR的问题，痛苦！
1.png


PCR的问题，痛苦！-1
85000F2C9B404366A35CD7F31F7F1EC9.jpg

[ Last edited by 1949stone on 2013-7-1 at 07:46 ]
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1楼 2013-06-30 19:42:51
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zou43118217

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
15楼: Originally posted by liyongliangx at 2013-07-01 13:43:14
不是说时间久了 为非特异性扩增吗？...

特异性扩增的最主要原因还是引物的特异性不够，就是太短，使得TM值越高，特异性越高，换引物吧，从来没用过TM值这么低的引物，我一般设TM为68℃的引物，而后根据酶选择不同选取适合合适的退火温度，像UtraPF一般就是62℃
赞一下 回复此楼
19楼2013-07-01 16:57:52
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liyongliangx

铜虫 (小有名气)
作者告诉我他们用50-55退火温度都可以 ，但我做了后全是弥散带，做了梯度后发现最好就是这样了，再高的温度就没有带了。。
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2楼2013-06-30 19:55:06
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透明的玻璃杯

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
1949stone: 金币+2, 不错 2013-07-01 07:47:08
亮的是2K吗？
作者告诉我他们用50-55退火温度都可以,反应条件是退火60度. 这一点不清楚，你试过50没有？
引物0.2ul, 有没有试过多加点？
要不再另外找家公司合成新的引物试试，反正也不贵。

我能想到的就是这些，祝好运！
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皇帝诞生地
3楼2013-06-30 20:37:12
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animbiotech

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
1949stone: 金币+1, 现在酶的质量一般都很好了 2013-07-01 07:47:30
建议换另外一家Taq酶
赞一下(2人) 回复此楼
4楼2013-06-30 22:25:59
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