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liyongliangx

铜虫 (小有名气)

[求助] PCR的问题,痛苦!

做了一个PCR ,结果如图:10ul的体系,酶用的Phusion mix,加样5ul ,引物 20uM 0.2ul,模板1ng/ul 0.2ul,ddH2O补至10 ul。
反应条件是退火60度,延伸72 1min。  
要扩增的片段大小为2000bp。
引物为别人文献里报道的,
用了PRIMER 5.0  分析结果也在附件中,我问过了原作者,他告诉我他们扩增的没有问题。但是不知道我这哪里出了问题。作者告诉我他们用50-55退火温度都可以 ,但我做了后全是弥散带,做了梯度后发现最好就是这样了,再高的温度就没有带了。。。
希望大家帮我分析分析。
先进的同学帮助下后进的同学。
PCR的问题,痛苦!
1.png


PCR的问题,痛苦!-1
85000F2C9B404366A35CD7F31F7F1EC9.jpg

[ Last edited by 1949stone on 2013-7-1 at 07:46 ]
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透明的玻璃杯

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
1949stone: 金币+2, 不错 2013-07-01 07:47:08
亮的是2K吗?
作者告诉我他们用50-55退火温度都可以,反应条件是退火60度. 这一点不清楚,你试过50没有?
引物0.2ul, 有没有试过多加点?
要不再另外找家公司合成新的引物试试,反正也不贵。

我能想到的就是这些,祝好运!
皇帝诞生地
3楼2013-06-30 20:37:12
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查看全部 22 个回答

liyongliangx

铜虫 (小有名气)

作者告诉我他们用50-55退火温度都可以 ,但我做了后全是弥散带,做了梯度后发现最好就是这样了,再高的温度就没有带了。。
2楼2013-06-30 19:55:06
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animbiotech

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
1949stone: 金币+1, 现在酶的质量一般都很好了 2013-07-01 07:47:30
建议换另外一家Taq酶
4楼2013-06-30 22:25:59
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m_marion

新虫 (小有名气)


1949stone: 金币+1, 有钱有的时候也不是好事啊 要看自身需要 最好问问楼主使用来做啥的 2013-07-01 07:48:33
引用回帖:
4楼: Originally posted by animbiotech at 2013-06-30 22:25:59
建议换另外一家Taq酶

开什么玩笑?Phusion是高保真酶,要换也是换别的高保真酶,换Taq是嫌测序经费花不掉么?
5楼2013-06-30 23:26:57
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