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连接转化假阳性提不出来质粒吗？
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我做连接转化两个月了，还没出结果，心情相当之郁闷！请教大家几个问题： 1、100ul大体系酶切，酶加2ul够吗？我没有直接这样加过，一直是按照20ul的体系，质粒10ul，酶各1ul，10×buffer 2ul，补水到20ul。然后按这个比例扩大5倍，即100ul体系，酶切3h。但是还是酶切不完全，会出现三条带，再胶回收目的片段后浓度更低了，通常只有10ng/ul左右。 2、我的载体两个酶切位点之间只有6个碱基，用的是宝生物的Kpn 1和Xba 1，同时进行双酶切。两个酶都做过单酶切对照，都能完全切成线性载体。所以我就直接拿双酶切载体进行连接了。 3、连接采用的10ul体系：目的片段1755bp，载体2548bp，按照3:1的比例加，宝生物T4连接酶1ul，buffer 1ul。连接后取5ul电转50ul感受态。结果5个板子只有一个长菌了。挑了80多个样PCR全部阴性。但是菌落变黄显示的是阳性结果，看来全是假阳性了。由于菌株时阳性菌，我怕PCR前面预热时间短没有把细菌壁破掉，所以又重新提质粒检测了下，结果质粒也没有。如果是假阳性，载体没有切完全，或者是载体发生自连了，那质粒应该能提出来吧？ 4、对照组，我直接转的空质粒，提质粒后发现是正确的。直接转的连接产物，就全是假阳性，也提不出来质粒。 5、T4连接酶用时是在冰上操作，T4 buffer用分装吗？每次都必须在冰上融化完全才能加？ 6、连接时能直接用T载体中的solution I 吗？ 实验室没人做过这些，所以很是苦恼，希望大家给予帮助，先感谢！ |
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hedyzero2楼2013-06-24 21:52:16
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酶切效果是与底物的量（质粒的μg数）及酶的活力（U）有关的，不能只考虑质粒体积建立酶切体系。你先把提好的质粒定量后做酶切，可以用小体积电泳检测酶切效果。一般是确认酶切完全后再做胶回收的。 如果提不出来质粒，可能是污染了杂菌或者是筛选抗生素的浓度不够。 两个酶切位点之间相差6个碱基已经不少了，应该不太影响效率，可以完全切开的。酶切后的载体最好也做胶回收。 T4连接酶一般16度过夜比较好。buffer一般不分装，当然分装会比较好。buffer需要完全融化后才能使用，一般是在室温下才能完全溶解的。融化后放在冰上操作。 连接时可以用T载体的solution I。 |
3楼2013-06-24 23:37:38
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1949stone: 回帖置顶 2013-06-25 12:30:36
1949stone: 可以放到原帖子里 2013-06-25 12:30:54
1949stone: 可以放到原帖子里 2013-06-25 12:30:54
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多谢多谢！！！！ 1、一般胶回收目的片段时做的双酶切，肯定是越多回收的片段浓度才会越高。一般都用多大体系双酶切呢？我的质粒一般是50ng/ul左右。。按照宝生物的说明书，20ul体系 1 ul 的酶可以切1ug DNA，那么20ul双酶切体系中我质粒加10ul 不多吧，或者是少？ 2、我的菌还有质粒都是食品级的，筛选标记是乳糖，转进去的在乳糖为唯一碳源情况下能生长且菌落变为黄色，没转进去的原则上是不能在乳糖培养基上生长的。我挑的黄色菌落PCR阴性，提质粒也没提出来。如果是能生长的话应该是含有质粒的。 3、有人说T4 buffer中含有ATP，反复冻融会失活。这样子在室温融化以后，用完再放回-20会不会有影响呢？实验室没人做过，也不知道该怎么操作了，纠结的。 4、目的片段跟表达载体连接时，用T4 好还是solution I 好呢？连接的体系最好多大？ |
5楼2013-06-25 11:54:25
武穆大成
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1. 根据你的质粒浓度，的确量不是很多。但存储质粒的缓冲液里有少量EDTA，如果质粒用的体积大了会抑制后面的酶切作用，如果质粒纯度不高，问题就更大了。根据个人经验，一般高拷贝质粒提出来的浓度都有几百ng/μl。 2. 可能与你的筛选培养基有关，我不清楚乳糖筛选是否非常严格。 3. 虽然是这么说，不过我们实验室的buffer是不分装了，N多人都用，也没见有什么问题。如果你怕出问题就分装成小管。 4. 克隆时连接一般很少出问题，T4或者solution I都应该可以的。连接体系一般是10μl或者20μl。 |
7楼2013-06-26 02:27:26
8楼2013-06-26 09:29:23
cicelyzh
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