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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 连接转化假阳性提不出来质粒吗？
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hedyzero

铁虫 (初入文坛)

[求助] 连接转化假阳性提不出来质粒吗？

我做连接转化两个月了，还没出结果，心情相当之郁闷！请教大家几个问题：

1、100ul大体系酶切，酶加2ul够吗？我没有直接这样加过，一直是按照20ul的体系，质粒10ul，酶各1ul，10×buffer 2ul，补水到20ul。然后按这个比例扩大5倍，即100ul体系，酶切3h。但是还是酶切不完全，会出现三条带，再胶回收目的片段后浓度更低了，通常只有10ng/ul左右。

2、我的载体两个酶切位点之间只有6个碱基，用的是宝生物的Kpn 1和Xba 1，同时进行双酶切。两个酶都做过单酶切对照，都能完全切成线性载体。所以我就直接拿双酶切载体进行连接了。

3、连接采用的10ul体系：目的片段1755bp，载体2548bp，按照3:1的比例加，宝生物T4连接酶1ul，buffer 1ul。连接后取5ul电转50ul感受态。结果5个板子只有一个长菌了。挑了80多个样PCR全部阴性。但是菌落变黄显示的是阳性结果，看来全是假阳性了。由于菌株时阳性菌，我怕PCR前面预热时间短没有把细菌壁破掉，所以又重新提质粒检测了下，结果质粒也没有。如果是假阳性，载体没有切完全，或者是载体发生自连了，那质粒应该能提出来吧？

4、对照组，我直接转的空质粒，提质粒后发现是正确的。直接转的连接产物，就全是假阳性，也提不出来质粒。

5、T4连接酶用时是在冰上操作，T4 buffer用分装吗？每次都必须在冰上融化完全才能加？

6、连接时能直接用T载体中的solution I 吗？

实验室没人做过这些，所以很是苦恼，希望大家给予帮助，先感谢！
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1楼2013-06-24 19:15:29
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武穆大成

木虫 (著名写手)

笨蛋

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by hedyzero at 2013-06-25 11:43:31
多谢！...

不谢，祝好实验顺利
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6楼2013-06-25 13:59:35
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武穆大成

木虫 (著名写手)

笨蛋

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-06-25 10:33:20
1，酶切反应：质粒要定量。根据质粒的量加酶，说明书上有使用比例，双酶切后胶回收，。回收的大小要了解。
2，连接：按照mol比，载体和插入片段比为1：10。。建议载体0.03pmol ，插入片段0.3pmol。。16度过夜。
每一步都定量做，成功的概率高
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hedyzero
2楼2013-06-24 21:52:16
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-06-25 10:33:36
hedyzero: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-06-25 11:44:58
1949stone: MolEPI+1, good 2013-06-25 12:30:21
酶切效果是与底物的量（质粒的μg数）及酶的活力（U）有关的，不能只考虑质粒体积建立酶切体系。你先把提好的质粒定量后做酶切，可以用小体积电泳检测酶切效果。一般是确认酶切完全后再做胶回收的。
如果提不出来质粒，可能是污染了杂菌或者是筛选抗生素的浓度不够。
两个酶切位点之间相差6个碱基已经不少了，应该不太影响效率，可以完全切开的。酶切后的载体最好也做胶回收。
T4连接酶一般16度过夜比较好。buffer一般不分装，当然分装会比较好。buffer需要完全融化后才能使用，一般是在室温下才能完全溶解的。融化后放在冰上操作。
连接时可以用T载体的solution I。
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3楼2013-06-24 23:37:38
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hedyzero

铁虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by 武穆大成 at 2013-06-24 21:52:16
1，酶切反应：质粒要定量。根据质粒的量加酶，说明书上有使用比例，双酶切后胶回收，。回收的大小要了解。
2，连接：按照mol比，载体和插入片段比为1：10。。建议载体0.03pmol ，插入片段0.3pmol。。16度过夜。
每 ...

多谢！
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4楼2013-06-25 11:43:31
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