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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 16s引物扩增大肠杆菌，产物不是1500，而是在700上下各有一条带
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119904386

铁虫 (小有名气)

[求助] 16s引物扩增大肠杆菌，产物不是1500，而是在700上下各有一条带

用的是这对引物：
16s-F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3
16s-R：5-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3

开始是因为拿这对引物扩增芽孢杆菌得不到目的条带，直接做的菌液PCR，未煮沸也没提取DNA。于是就怀疑芽孢菌是不是形成芽孢后95度预变性破坏不了菌体（预变性10min还是不行），无法释放出DNA模板。所以，想拿G-菌（大肠杆菌）做个对照。奇怪的是，大肠杆菌的扩增产物并不是1.5kb，而是在marker 700bp上下各有一条带（也许加起来1.5kb），同时芽孢菌还是没有带

求解
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1楼 2013-06-10 22:36:44
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志子

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+4, good！ 2013-06-11 12:43:28
预变性时间、退火温度、引物用量是主要影响因素，可从这几方面去做正交试验探索。
菌没有完全裂解，则试沸水浴或延长预变性时间。
引物如果反复冻融的话有可能会裂解断裂。
菌株的遗传性状不稳定，或许在传代的过程中产生了突变；菌株不纯，体系中出现了污染也有可能的。导致模板不纯。
菌株正常，会不会是引物浓度太高，如果引物的浓度很高产生引物二聚体的概率就比较高。
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2楼2013-06-10 22:52:43
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肥猫p

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我是用341f和907r
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3楼2013-06-12 10:33:49
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