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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 酶的硫酸铵沉淀
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天叶之羽

新虫 (初入文坛)

[求助] 酶的硫酸铵沉淀

我做的酶的纯化，打算首先采用硫酸铵沉淀法从发酵液中得到粗酶，但是硫酸铵浓度到90%，冰箱内过夜后，再8000g离心半小时后，目的酶基本还是在溶液里，没有沉淀出来！我看文献里基本到80%就沉淀出来了。
    现在我有两个疑问：1、是不是因为发酵液中蛋白含量太低（约0.1mg/mL），导致的目的酶在高硫酸氨浓度仍沉淀不出？怎样可以有效地酶没沉淀下来呢？
    2、超滤对酶活有很多损失吗？

希望能在这收集到大家的建议，帮助我实验顺利进行。
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1楼2013-06-05 19:19:22
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

sars2012

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
yqbter: 金币+2, 鼓励发帖！ 2013-06-06 13:59:24
天叶之羽(wizardfan代发): 金币+1, 谢谢参与 2013-06-11 06:44:00
粗酶液有几升？
硫酸铵沉淀在冰水浴中进行 我们实验室一般敲完硫酸铵冰水浴搅拌1h就可以了 放冰箱过夜效果不好
按理说蛋白量再少也会多少有些沉淀 是不是离心转速不够？我们实验室1W转10min 沉淀就可以出来

超滤要看酶而定，最好在低温下进行 而且 有些酶压力过大容易引起变性

我能想到的就这些 我是新手 有不足之处望请见谅。。
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4楼2013-06-06 11:04:32
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+2, 谢谢分享经验 2013-06-08 00:05:36
天叶之羽(wizardfan代发): 金币+1, 谢谢参与 2013-06-11 06:44:14
硫酸铵沉淀对于粗蛋白蛋白浓度要求最好是1mg/ml。如果蛋白质浓度过低，硫酸铵沉淀效果就不太好了，会损失大量的蛋白质。
如果你的体积不是很大，可以超滤浓缩，不会使酶失活的。
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6楼2013-06-07 09:15:25
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普通回帖

冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+2, 谢谢分享经验 2013-06-06 07:43:57
天叶之羽(wizardfan代发): 金币+1, 谢谢参与 2013-06-11 06:43:46
同一种酶的性质也是有不同的，别人的实验结果怎么说也是别人的，不一定自己的就也那样，以自己的实验结果为准。

超滤一般不会使酶活力有损失。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
2楼2013-06-06 03:23:17
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天叶之羽

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2013-06-06 03:23:17
同一种酶的性质也是有不同的，别人的实验结果怎么说也是别人的，不一定自己的就也那样，以自己的实验结果为准。

超滤一般不会使酶活力有损失。

发酵液需要浓缩后再用硫酸铵沉淀吗？这一步解决不了我的实验进行不下去。
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3楼2013-06-06 09:06:16
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天叶之羽

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by sars2012 at 2013-06-06 11:04:32
粗酶液有几升？
硫酸铵沉淀在冰水浴中进行 我们实验室一般敲完硫酸铵冰水浴搅拌1h就可以了 放冰箱过夜效果不好
按理说蛋白量再少也会多少有些沉淀 是不是离心转速不够？我们实验室1W转10min 沉淀就可以出来

超 ...

测最适沉淀浓度都用的100mL粗酶液。。是在冰水浴中加的硫酸铵。。
    请教一下，冰箱过夜会不会因为时间长而导致沉淀出的蛋白复溶呢？
  8000g的转速有蛋白，只是沉淀的目的蛋白很少。
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5楼2013-06-06 19:33:35
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天叶之羽

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by dshlove at 2013-06-07 09:15:25
硫酸铵沉淀对于粗蛋白蛋白浓度要求最好是1mg/ml。如果蛋白质浓度过低，硫酸铵沉淀效果就不太好了，会损失大量的蛋白质。
如果你的体积不是很大，可以超滤浓缩，不会使酶失活的。

超滤浓缩的体积上限可以到多少呢？
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7楼2013-06-08 17:19:27
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by 天叶之羽 at 2013-06-08 17:19:27
超滤浓缩的体积上限可以到多少呢？...

看你用什么了？
浓缩管当然是越小越好，切向流过滤的话，可以很多。
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8楼2013-06-08 19:41:26
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天叶之羽

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by dshlove at 2013-06-08 19:41:26
看你用什么了？
浓缩管当然是越小越好，切向流过滤的话，可以很多。...

你说的是那种用在离心管里的浓缩管么？？我问的是那种超滤仪。。不过都木有用过。。
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9楼2013-06-09 21:31:51
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
天叶之羽(wizardfan代发): 金币+2, 谢谢参与 2013-06-10 04:01:56
引用回帖:
9楼: Originally posted by 天叶之羽 at 2013-06-09 21:31:51
你说的是那种用在离心管里的浓缩管么？？我问的是那种超滤仪。。不过都木有用过。。...

将试剂装入Millipore超滤离心管里，根据里面有不同孔径的滤膜Millipore超滤离心管有多种规格，拧上盖子，放在离心机转头里，对侧转头加与它质量大致相同的装入水的离心管，然后离心。
非蛋白质物质的分子量与蛋白质差距很大，只要选一个Millipore超滤离心管的滤膜的孔径（厂家的说明书上已经换算成分子量）能够透过非蛋白质但是不会透过蛋白质的规格的Millipore超滤离心管就行。
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10楼2013-06-09 22:29:51
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