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cc1000ml

金虫 (正式写手)

[求助] 求可以去除真菌孢子,而不去掉蛋白的离心速度!!!

最近在做真菌产纤维素酶的实验,在制备粗酶液的时候,离心速度一直把握不好,怕最后制备的上清有真菌的孢子,会影响最后的实验结果,弱弱的问哈,有没有同学对这方面有了解的,离心速度为多少时,既能够去除上清中的真菌孢子,又不影响蛋白的获得?
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徐无鬼
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phoenix.ren

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
amisking: 金币+1, 鼓励发帖交流问题。 2012-04-30 16:58:07
cc1000ml: 金币+2, 有帮助 2012-04-30 18:41:57
过滤应该可以去除,尝试用滤膜。
2楼2012-04-30 15:13:09
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glucidum

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
zhang8826857: 金币+2, 鼓励交流 2012-04-30 18:17:42
如果要求完全没有孢子,那请用膜过滤除菌;
离心去掉大部分孢子的话,如果在蒸馏水中(溶液黏度很低)那1000g应该足够了,如果溶液黏度大就不好说了;
LZ想要的是酶液,蛋白的分子很小,如果是水溶性蛋白,直接离心是很难把蛋白离下来的,平常万儿八千g的离心力都不会有问题。

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3楼2012-04-30 17:48:31
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391579557

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
zhang8826857: 金币+3, 鼓励交流 2012-04-30 18:17:51
其实,个人觉得膜滤之前还是要离心的。因为“膜”这个东西用过的人都知道:用着很蛋疼。
问个问题:你的酶会在发酵中析出?
还是个人觉得:你可以做个实验:1、4000 rpm离心20分钟(我觉得这个速度初步除去孢子够了),在0.22 μm微滤酶液,测酶活;2、滤纸过滤2次,0.22 μ膜滤,测酶活。比较其差异。如果楼主想提高离心转速,可将“1”改为梯度实验。
呵呵,可能楼主会认为麻烦,纤维素酶活的滤纸法测定是酶活测定当中,比较简单的了。

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求实,所以来小木虫!
4楼2012-04-30 18:12:38
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cc1000ml

金虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by phoenix.ren at 2012-04-30 15:13:09:
过滤应该可以去除,尝试用滤膜。

谢谢提醒~我试试
徐无鬼
5楼2012-04-30 18:41:36
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cc1000ml

金虫 (正式写手)

送鲜花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by glucidum at 2012-04-30 17:48:31:
如果要求完全没有孢子,那请用膜过滤除菌;
离心去掉大部分孢子的话,如果在蒸馏水中(溶液黏度很低)那1000g应该足够了,如果溶液黏度大就不好说了;
LZ想要的是酶液,蛋白的分子很小,如果是水溶性蛋白,直接 ...

嗯,我今天做了一下玻片,显微观察,发现5000rpm(具体换算成g是多少没仔细看...)离心得到的上清,有很多的孢子,溶液粘度非常大...我试试用滤膜的效果。鲜花一朵~~
徐无鬼
6楼2012-04-30 18:44:48
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cc1000ml

金虫 (正式写手)


送鲜花一朵
zhang8826857: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-02 23:27:49
引用回帖:
4楼: Originally posted by 391579557 at 2012-04-30 18:12:38:
其实,个人觉得膜滤之前还是要离心的。因为“膜”这个东西用过的人都知道:用着很蛋疼。
问个问题:你的酶会在发酵中析出?
还是个人觉得:你可以做个实验:1、4000 rpm离心20分钟(我觉得这个速度初步除去孢子 ...

这个酶应该是水溶性的,不会析出。
  您给出的建议很具体,但是我现在面临的问题是这样的:因为酶活太低,所以我想把酶的浓度增大,上午做了透析,效果不是很好,应该是因为杂质太多了...
   这株菌的酶活非常低,要反应20多个小时才能有效果,因为时间过长,我怕孢子会有一定量的生长,消耗掉酶降解的还原糖,所以想彻底去除孢子,避免其可能造成的影响!
    我试下膜滤~~
徐无鬼
7楼2012-04-30 18:49:08
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391579557

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by cc1000ml at 2012-04-30 18:49:08:
这个酶应该是水溶性的,不会析出。
  您给出的建议很具体,但是我现在面临的问题是这样的:因为酶活太低,所以我想把酶的浓度增大,上午做了透析,效果不是很好,应该是因为杂质太多了...
   这株菌的酶活非常 ...

呵呵,好的。不知道你使用什么作为底物产纤维素酶。如果底物合适,试一下“固态发酵”。
个人认为,其实制纤维素酶技术已经蛮成熟的,就是分离太难。很多人固态发酵效果都很好。
求实,所以来小木虫!
8楼2012-04-30 20:28:47
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glucidum

金虫 (正式写手)


rainwander: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-02 08:33:33
引用回帖:
7楼: Originally posted by cc1000ml at 2012-04-30 18:49:08:
这个酶应该是水溶性的,不会析出。
  您给出的建议很具体,但是我现在面临的问题是这样的:因为酶活太低,所以我想把酶的浓度增大,上午做了透析,效果不是很好,应该是因为杂质太多了...
   这株菌的酶活非常 ...

黏度大,用膜会很痛苦的,经常累死累活的只滤出一点点。4楼朋友说的是实情,建议LZ一点考虑!不过我建议用孔径大一点的滤膜,如0.45um的。
还有,不知道LZ的粗酶液经过哪些预处理?先把粘稠的成分与目标酶分离开比较好,不知道用硫酸铵沉淀一下有没有效果?
9楼2012-05-01 23:19:07
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zzz119

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
zhang8826857: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-02 23:27:58
低速4000rpm就行,孢子一般大小1-2个um大小,放置时间长了,也会自己沉淀
10楼2012-05-02 15:53:10
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