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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于硫酸铵沉淀的问题
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quinn

铁虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】关于硫酸铵沉淀的问题 已有7人参与

我在做酶纯化，先把发酵液硫酸铵分级沉淀，结果每一级都有活性，也有蛋白，比活都差不多，一点都没分开。于是我又把分级的沉淀合并过超滤膜，先过的十万的膜，结果蛋白都在十万以上，十万以下几乎什么都没有。我觉得这个结果有问题，怎么可能两种方法都一点效果都没有。而且发酵液里怎么会没有十万以下的蛋白呢？这到底是为什么呢？亲们，谁能告诉我呀，或者有谁有过同样的情况啊！
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古之成大事者，不惟有超士之才，亦有坚忍不拔之志
1楼 2010-07-06 10:02:26
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天外飞仙→顺

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
估计是膜有问题，，，
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我无法改变自己的出生，但我可以决定自己的命运：命中注定我是一个王者，我必须拿出王者的风范！！！
2楼2010-07-06 10:25:32
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很想跟你走

铁虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+2):很详细，感谢交流~~ 2010-07-09 17:06:32
先说硫酸铵沉淀
你可以先做个小试：将样品分成五等分，每等份分别加入20%、30%40%、50%、60%的硫酸铵。取上清去沉淀，然后再分别往上清中加入硫酸铵至：30%、40%、50%、60%、70%。取沉淀再溶解测活性。这样就能大致清楚你所需要蛋白的沉淀浓度了。
关于超滤也有很多实际问题。超滤膜给出的分子量数值只是一个大致的范围，它不可能分的很准确，一般要选择比目标蛋白大2-3倍左右的膜来分离。比如你所需要分离的蛋白分子量有5万，那么你就要选择10万-15万的膜。
楼主所说的将分级沉淀合并过10万膜，很有可能过下去的分子量都在5万以下，甚至更低，结合你自己的实验条件，你的发酵液里小分子量蛋白可能比较少。
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3楼2010-07-09 16:06:38
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刘小乐

铜虫 (小有名气)
★
dhd997(金币+1):今天很活跃，谢谢交流。 2010-07-12 13:11:54
我觉得你有必要先做一个电泳，鉴定一下你的酶液中蛋白分子量和种类，然后再测定一下分级沉淀下蛋白的分子量是不是你想要的目的蛋白
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互动互利互相学习
4楼2010-07-12 12:53:39
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jqq1985

银虫 (正式写手)
10万也就是100Kd，有些蛋白都是几聚体，分子量很容易就超过100kd。另外，不是所有的蛋白都可以用硫酸铵进行梯度沉淀的。建议跑胶看看发酵液中的蛋白质成分，另外采取其他的纯化方式。
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5楼2010-07-12 15:29:20
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caoyi0810

新虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
蛋白层析仪试试吧。。。
硫酸铵算是比较粗略的方法了，一般都是粗酶液才用硫酸铵沉淀的。。。
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伪小资要花粪涂墙~
6楼2010-07-12 16:09:36
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quinn

铁虫 (初入文坛)
谢谢各位，我正在做电泳，结果还没出来呢！
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古之成大事者，不惟有超士之才，亦有坚忍不拔之志
7楼2010-07-17 13:52:07
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chaoen

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by quinn at 2010-07-17 13:52:07:
谢谢各位，我正在做电泳，结果还没出来呢！

电泳结果如何呢？
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8楼2011-01-13 22:04:03
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