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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】硫酸铵分级沉淀
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04swlcm

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】硫酸铵分级沉淀 已有7人参与

大家好：
       我想请教大家是怎么去得到硫酸铵分级沉淀曲线的？我做了20-90%梯度，加的是固体硫酸铵，发现每个梯度上清酶活相差不大，并没得到两个点（一个上清酶活很高，一个上清几乎没酶活），请问大家是什么原因？谢谢
     还有过DEAE-纤维素阴离子柱的时候，一共出现3个峰，就在前面几管（3-5管）就出现目的蛋白，而且只有这个峰有酶活，我怀疑是没挂上柱子，怎么改进啊？PAGE无条带~郁闷~~（目的蛋白等电点4.9，平衡缓冲液是0.05M的HAc-NaAc，PH5.5，用的是0.5MNaCl，0.05MHAc-NaAc梯度洗脱）。

[ Last edited by 04swlcm on 2010-4-28 at 10:37 ]
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1楼 2010-04-17 23:23:09
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shwang007

木虫 (正式写手)
04swlcm(金币+1): 2010-04-19 10:38
不知LZ做的是哪个酶？测定方法是否稳定，尤其是反应体系不稳定会导致上述结果。
首先，DEAG是阴离子交换剂，平衡液的PH值与目的蛋白的PI太靠近，自然挂不上柱；建议提高buffer的PH降低其离子强度。如还不行，可以联系shwang70@yahoo.com.cn
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2楼2010-04-18 10:36:26
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04swlcm

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 04swlcm at 2010-04-17 23:23:09:
大家好：
       我想请教大家是怎么去得到硫酸铵分级沉淀曲线的？我做了20-90%梯度，加的是固体硫酸铵，发现每个梯度上清酶活相差不大，并没得到两个点（一个上清酶活很高，一个上清几乎没酶活），请问大家是什 ...

谢谢啊，我做的是植酸酶，还是搞不太清楚呢，过柱时，我是不是可以吧缓冲液PH调高点，离子强度调低一点，主要是测酶活PH在5.5，所以选择5.5
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3楼2010-04-19 10:42:38
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rhy1027

金虫 (正式写手)
04swlcm(金币+1): 2010-04-28 10:12
0.5MNaCl？这么高的盐浓度怎么去做离子交换？调高pH,或者将盐浓度降低到50mM
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4楼2010-04-20 22:57:04
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
★ ★
04swlcm(金币+2): 2010-04-28 10:23
lstt09nk(金币+2): 2010-04-28 20:08
1、DEAE是一种弱阴离子交换树脂，不是阳离子交换剂。
2、离子交换的原理是低盐吸附，高盐洗脱。你的平衡缓冲盐浓度太高了。一般样品溶液的缓冲和盐浓度应和平衡缓冲一样，应该只有缓冲液，不另外添加其他盐类，以降低离子强度，增加结合的能力。
3、纯化时样品和缓冲的pH应与等电点有较大的差距，阴离子交换层析一般选择PB或Tris缓冲较好，前者pH7.4，或者9.0。你选择的乙酸盐缓冲pH5.5一般是阳离子交换的缓冲。
4、纯化时的pH可以与测酶活时的不一样啊，你纯化完了，如果要在某个pH下测酶活，你可以把Ph调过去测就可以了。
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5楼2010-04-20 23:27:24
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
★
lstt09nk:欢迎多多交流~~ 2010-04-28 20:08
scelab(金币+1):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-04-30 16:00
我的建议：
如果用DEAE或Q填料来纯化的话，你可以选择如下缓冲：
平衡缓冲：20mM PB，pH7.4；
洗脱缓冲：20mM PB，1M NaCl，pH7.4。
洗脱的时候，如果有纯化仪，就用线性梯度洗脱，如果没有，你就自己配置几个浓度的洗脱液分别洗。
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6楼2010-04-20 23:30:11
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04swlcm

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by rhy1027 at 2010-04-20 22:57:04:
0.5MNaCl？这么高的盐浓度怎么去做离子交换？调高pH,或者将盐浓度降低到50mM

谢谢啦，我看好多文献不都是用（0-0.5M） NaCl梯度洗脱吗？我是用0.5M
NaCl和50mM HAc-NaAc缓冲液梯度洗脱的，这样可以吗？
我下次就准备调高一点点PH，呵呵，谢谢你们啊！
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7楼2010-04-28 10:17:42
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04swlcm

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by snoopyzxx at 2010-04-20 23:30:11:
我的建议：
如果用DEAE或Q填料来纯化的话，你可以选择如下缓冲：
平衡缓冲：20mM PB，pH7.4；
洗脱缓冲：20mM PB，1M NaCl，pH7.4。
洗脱的时候，如果有纯化仪，就用线性梯度洗脱，如果没有，你就自己配置几个 ...

呵呵，非常感谢你的建议，我做的是植酸酶，最适PH5.6，在PH7.5左右就失活了，如果我选择平衡缓冲：20mM PB，pH7.4，应该不可以吧？
植酸酶的等电点在4.9
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8楼2010-04-28 10:34:18
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
04swlcm(金币+1): 2010-04-28 21:04
关键是如果在高ph条件下失活后，如果把ph再调回去，活性能不能恢复？
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9楼2010-04-28 20:11:37
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04swlcm

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by snoopyzxx at 2010-04-28 20:11:37:
关键是如果在高ph条件下失活后，如果把ph再调回去，活性能不能恢复？

酶变性后会有沉淀，沉淀在柱上能洗脱吗？变性后调PH就复性没那么容易吧？嘿嘿，谢谢你教了我那么多，额呵呵。
我先还是用我的缓冲液，降低点离子强度和升高点PH试试，你觉得克星吗？
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10楼2010-04-28 22:30:38
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