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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核表达蛋白
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xjtu0025

新虫 (小有名气)

[求助] 原核表达蛋白

自己构建好了载体，pET-32a的融合表达。第一次做表达，小肽，插进去的大概就是90aa的样子。由于我的目的蛋白不是现有的蛋白，我诱导条件那些要怎么样才能确定呢？是胞内表达还是胞外表达要如何确定呢？
没有相关文献的，因为没人做过。

我想知道大概是如何确定的，我现在是用BL21和ROSSETA做表达菌，然后摇菌过夜，iptg，37度诱导1个小时，1个半小时，两个小时。转速220左右。。主要是我因为没有目的条带的大小标准。。估计是30多KD左右。。
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1楼 2013-06-04 19:12:49
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王者归来001

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xjtu0025(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-06-05 09:08:54
xjtu0025: 金币+4 2013-06-07 16:35:47
要先进行IPTG浓度，菌液OD值以及诱导时间的梯度试验，诱导时间选择上应有更长的时间，看目标蛋白的诱导情况，可分全菌、细胞破碎后上清液和沉淀，跑电泳观察，这99aa的序列的大小在30KD的话就选用合适的蛋白标准去跑胶观察
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坚持不懈,终会成功!
2楼2013-06-04 22:59:32
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linxt2005

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xjtu0025(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-06-05 09:09:07
xjtu0025: 金币+4 2013-06-07 16:35:50
1. 是否融合了标签呢？如果没有99aa应该是10kDa左右吧。
2. 表达过程中可以通过设置阴性对照，来对比表达的效果而间接做判断。
3. 如果有亲和标签，也可以通过WB来验证。

没有参考资料关系不大，根据目的蛋白的性质来设置表达条件就可以，一般可先测试基本的条件，
至于是胞内表达还是分泌表达，跟你使用的载体或者构建的方法有关，pET32a应该是胞内表达的。
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小兵一个
3楼2013-06-05 09:04:26
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xjtu0025

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by linxt2005 at 2013-06-05 09:04:26
1. 是否融合了标签呢？如果没有99aa应该是10kDa左右吧。
2. 表达过程中可以通过设置阴性对照，来对比表达的效果而间接做判断。
3. 如果有亲和标签，也可以通过WB来验证。

没有参考资料关系不大，根据目的蛋白的 ...

谢谢呀，我已经表达出来了。。
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4楼2013-06-07 16:35:38
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wuwenmei

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by xjtu0025 at 2013-06-07 16:35:38
谢谢呀，我已经表达出来了。。...

你用32a是胞内表达还是胞外表达呀，目的序列来着真核生物还是原核生物呀，
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下雨天就算没有伞，我也要学会努力奔跑！
5楼2015-05-28 09:46:12
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