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jasminezhao

金虫 (小有名气)

[交流] PCR和酶切实验 已有5人参与

我有一个问题,就是我的载体含有两个sfiI酶切位点,并且正好是位于目的基因的两端,我为什么不能直接用酶切发法获得目的基因,而是要用PCR法获得目的基因后再酶切呢?我们教授要我这样做,但是我不是很理解,这样不更麻烦吗?有哪位大侠做过类似的实验还望指点迷津啊!!谢谢啦!!
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kx444555

至尊木虫 (正式写手)

★ ★
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gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-24 03:10:50
估计你们教授的意思是把整个ORF给扩增下来,加另外的酶切位点,如果用同一种酶切的话,插入方向还要后续确定,
再说你不用PCR你怎么大量扩增目的基因用来酶切呢?
星陈代谢
2楼2013-05-23 11:26:40
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-24 03:10:58
直接酶切下来可能对后续实验不利。比方说可能是要做表达,需要根据表达载体设计合适的酶切位点。
3楼2013-05-23 13:11:51
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xjtu0025

新虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
你切下来是要干啥呀....PCR不是只是得到产物而已,一般都带有大量扩增和改造
4楼2013-05-23 19:02:44
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野草99688

银虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
呵呵!你的目的片段如果实在松弛型质粒上,扩增后就不必再PCR啦!直接酶切纯化即可,但是你的目的片段如果实在严谨性质粒上,本来目的片段就很少,你在酶切,根本就检测不到,跟别说做其他试验啦,PCR可以加入酶切位点,也可以防止自身连接等。PCR扩增后获得大量序列,这样才能进行下一步操作呀!呵呵
1鄙人拙见,若有不对,还请指教呀!
5楼2013-05-24 09:06:33
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咆粑

银虫 (小有名气)


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如果你用sfiI酶切得到目的片段了,这个片段能不能再连到另外一个你需要连到载体上呢?
6楼2013-05-24 10:37:59
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