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jasminezhao

金虫 (小有名气)

[交流] PCR和酶切实验 已有5人参与

我有一个问题，就是我的载体含有两个sfiI酶切位点，并且正好是位于目的基因的两端，我为什么不能直接用酶切发法获得目的基因，而是要用PCR法获得目的基因后再酶切呢？我们教授要我这样做，但是我不是很理解，这样不更麻烦吗？有哪位大侠做过类似的实验还望指点迷津啊！！谢谢啦！！
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1楼 2013-05-23 10:46:19
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kx444555

至尊木虫 (正式写手)
★ ★
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gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-24 03:10:50
估计你们教授的意思是把整个ORF给扩增下来，加另外的酶切位点，如果用同一种酶切的话，插入方向还要后续确定，
再说你不用PCR你怎么大量扩增目的基因用来酶切呢？
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星陈代谢
2楼2013-05-23 11:26:40
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
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gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-24 03:10:58
直接酶切下来可能对后续实验不利。比方说可能是要做表达，需要根据表达载体设计合适的酶切位点。
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3楼2013-05-23 13:11:51
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xjtu0025

新虫 (小有名气)
★
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你切下来是要干啥呀....PCR不是只是得到产物而已,一般都带有大量扩增和改造
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4楼2013-05-23 19:02:44
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野草99688

银虫 (小有名气)
★
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呵呵！你的目的片段如果实在松弛型质粒上，扩增后就不必再PCR啦！直接酶切纯化即可，但是你的目的片段如果实在严谨性质粒上，本来目的片段就很少，你在酶切，根本就检测不到，跟别说做其他试验啦，PCR可以加入酶切位点，也可以防止自身连接等。PCR扩增后获得大量序列，这样才能进行下一步操作呀！呵呵
1鄙人拙见，若有不对，还请指教呀！
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5楼2013-05-24 09:06:33
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咆粑

银虫 (小有名气)
★
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如果你用sfiI酶切得到目的片段了，这个片段能不能再连到另外一个你需要连到载体上呢？
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6楼2013-05-24 10:37:59
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