应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 2.7Kb的片段连接问题
51/1返回列表
查看: 1688  |  回复: 6
只看楼主@他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

rainlark

禁虫 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼2013-05-13 15:26:55
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-24 03:18:36
引用回帖:
4楼: Originally posted by rainlark at 2013-05-15 12:36:27
谢谢cicelyzh，载体片段和目的片段都去磷酸化这个事不对的，我正在重新做酶切，这次都不加去磷酸化酶了。我比较担心的是载体没有切好，只进行了单酶切，出现这样的假阳性，双酶切后出现的条带应该和原质粒双酶切出 ...

如果担心双酶切载体时只进行了单酶切，可以在做双酶切的同时分别做两个酶的单酶切对照。如果这两个酶切位点不是相邻，切割效率应该与单酶切差不多，通过看两个单酶切的效果得知是否能顺利得到充分双酶切的产物。
赞一下 回复此楼
5楼2013-05-16 00:00:49
 已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 7 个回答

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-05-14 11:01:56
推荐你用infusion的方法做，质粒载体太大，不好操作的，你自己去搜什么是infusion方法
赞一下(1人) 回复此楼
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2013-05-14 02:03:52
 已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+3, 真心的经验，欢迎常来 2013-05-22 11:42:57
1. 载体片段和目的片段都去磷酸化后理论上不能相连。做双酶切连接一般不需要去磷酸化，因为连接的粘性末端不同。如果做去磷酸化，一般也是对载体片段做，不能两个都做。
2. 目的片段没有连上也是可能出现假阳性的，因为酶作用都是不完全的。而且，酶切条件不是最适合的时候，酶有可能有星活性。你说的克隆情况有些复杂，我觉得很可能是酶切没有切好。胶回收的载体片段可能含有单酶切产物。
我认为你做酶切时需要对质粒、PCR产物定量，根据DNA的量来确定酶的使用量，酶用量不要太大，有些酶对离子强度很敏感，酶切体系质粒的浓度不宜过高。
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2013-05-14 08:17:03
 已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

rainlark

禁虫 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
4楼2013-05-15 12:36:27
 已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 7 个回答
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭