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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 2.7Kb的片段连接问题
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rainlark

禁虫 (初入文坛)
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1楼 2013-05-13 15:26:55
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-24 03:18:36
引用回帖:
4楼: Originally posted by rainlark at 2013-05-15 12:36:27
谢谢cicelyzh，载体片段和目的片段都去磷酸化这个事不对的，我正在重新做酶切，这次都不加去磷酸化酶了。我比较担心的是载体没有切好，只进行了单酶切，出现这样的假阳性，双酶切后出现的条带应该和原质粒双酶切出 ...

如果担心双酶切载体时只进行了单酶切，可以在做双酶切的同时分别做两个酶的单酶切对照。如果这两个酶切位点不是相邻，切割效率应该与单酶切差不多，通过看两个单酶切的效果得知是否能顺利得到充分双酶切的产物。
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5楼2013-05-16 00:00:49
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-05-14 11:01:56
推荐你用infusion的方法做，质粒载体太大，不好操作的，你自己去搜什么是infusion方法
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2013-05-14 02:03:52
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+3, 真心的经验，欢迎常来 2013-05-22 11:42:57
1. 载体片段和目的片段都去磷酸化后理论上不能相连。做双酶切连接一般不需要去磷酸化，因为连接的粘性末端不同。如果做去磷酸化，一般也是对载体片段做，不能两个都做。
2. 目的片段没有连上也是可能出现假阳性的，因为酶作用都是不完全的。而且，酶切条件不是最适合的时候，酶有可能有星活性。你说的克隆情况有些复杂，我觉得很可能是酶切没有切好。胶回收的载体片段可能含有单酶切产物。
我认为你做酶切时需要对质粒、PCR产物定量，根据DNA的量来确定酶的使用量，酶用量不要太大，有些酶对离子强度很敏感，酶切体系质粒的浓度不宜过高。
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3楼2013-05-14 08:17:03
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rainlark

禁虫 (初入文坛)
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4楼2013-05-15 12:36:27
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