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rainlark

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cicelyzh

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gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-24 03:18:36
引用回帖:
4楼: Originally posted by rainlark at 2013-05-15 12:36:27
谢谢cicelyzh,载体片段和目的片段都去磷酸化这个事不对的,我正在重新做酶切,这次都不加去磷酸化酶了。我比较担心的是载体没有切好,只进行了单酶切,出现这样的假阳性,双酶切后出现的条带应该和原质粒双酶切出 ...

如果担心双酶切载体时只进行了单酶切,可以在做双酶切的同时分别做两个酶的单酶切对照。如果这两个酶切位点不是相邻,切割效率应该与单酶切差不多,通过看两个单酶切的效果得知是否能顺利得到充分双酶切的产物。
5楼2013-05-16 00:00:49
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gyesang

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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,感谢你的慷慨解囊,期待你的精彩。 2013-05-14 11:01:56
推荐你用infusion的方法做,质粒载体太大,不好操作的,你自己去搜什么是infusion方法
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2013-05-14 02:03:52
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

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小丹木木: 金币+3, 真心的经验,欢迎常来 2013-05-22 11:42:57
1. 载体片段和目的片段都去磷酸化后理论上不能相连。做双酶切连接一般不需要去磷酸化,因为连接的粘性末端不同。如果做去磷酸化,一般也是对载体片段做,不能两个都做。
2. 目的片段没有连上也是可能出现假阳性的,因为酶作用都是不完全的。而且,酶切条件不是最适合的时候,酶有可能有星活性。你说的克隆情况有些复杂,我觉得很可能是酶切没有切好。胶回收的载体片段可能含有单酶切产物。
我认为你做酶切时需要对质粒、PCR产物定量,根据DNA的量来确定酶的使用量,酶用量不要太大,有些酶对离子强度很敏感,酶切体系质粒的浓度不宜过高。
3楼2013-05-14 08:17:03
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rainlark

禁虫 (初入文坛)

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4楼2013-05-15 12:36:27
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