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飘零的叶子

新虫 (小有名气)

[求助] 蛋白透析过程中出现浑浊

我的目的蛋白是胞内可溶表达，破菌后离心取上清，将破碎上清对ph7.6的Tris-HCl缓冲液进行透析，透析过程中透析袋内出现浑浊，破菌缓冲液是含0.5M NaCl的ph8.5的Tris-HCl溶液，哪位大侠知道为什么透析过程中为什么会出现浑浊，该如何改进实验方案？！
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1楼 2013-05-11 14:30:22
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回帖置顶 ( 共有1个 )

不转录的DNA

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+5, MolEPI+1, 中肯的建议！ 2013-05-11 20:43:52
飘零的叶子: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-05-12 09:40:06
一般我们做蛋白先是破碎，再纯化，然后透析！
虽然不知道你破菌之后，透析蛋白用于干嘛？我猜可能是过阳离子柱是吧？
1）.因为你破碎之后，上清中是含有许多种类蛋白的，蛋白浓度越高，protein越容易Aggregated，然后形成沉淀！可能沉淀的并不是你的蛋白，而是杂蛋白！
我经常将一部纯化之后！的蛋白流出，放置在4度，第二天观察发现蛋白变浑浊了，离了心之后，分别取上清与沉淀电泳，结果显示我的蛋白仍在上清！

2）.通过透析换buffer来改变pH，可能会改变许多蛋白质的正确构象，使蛋白发生沉淀；也有可能是因为pH的改变刚好经过他的等电点，所以发生了沉淀！如果你的目的蛋白PI值在7.6~8.5之间，那么沉淀的可能是你的蛋白·····
3). 你的破碎buffer中含有500mM的盐，不知道你的透析buffer中含不含有？
总之，我也不知道你沉淀的蛋白是否是你的蛋白，你需要将其离心之后，分别取上清和沉淀跑一次SDS-PAGE！

你的方案得改进：
1. 最好在你的目的蛋白前加个标签，His或GST的。如果就只需要目的protein！！！那就在标签之后加个酶切位点吧！经过一步纯化之后，蛋白的浓度和纯度都会得到提高，一步纯化之后再透析不迟啊！
2.透析还是比较慢的，建议你用脱盐柱G25换你的buffer！
就这么多吧，希望能给你点建议！
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长得比我英俊的，没我有才华！有才华的，没我长得俊！
2楼2013-05-11 15:35:50
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

zhoupeng87

版主 (文学泰斗)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是不是因为缓冲液是含0.5M NaCl
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3楼2013-05-11 15:50:59
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草蔻年华

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
飘零的叶子(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-13 12:51:12
你的蛋白的等电点是多少，是不是蛋白析出了，可以调节透析液 的PH试试。
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4楼2013-05-11 20:44:17
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
飘零的叶子: 金币+3, ★有帮助 2013-05-13 09:31:03
飘零的叶子(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-13 12:51:02
液体浑浊就是其中的溶质的溶解度低，提高溶质的溶解度即可。让溶液pH离开蛋白质的pI，但是太酸或太碱，以免蛋白质变性，引起更多浑浊；另外，可能是其他的非目的的杂质太多了，离心、分级沉淀、层析分离出目的蛋白质，许多时候杂质不好去除，那么就想方设法把分离出目的蛋白质即可，最好的办法之一：亲和层析，可以用GST，(His)6标签，也可以不用。直接用目的蛋白质制备当克隆抗体（可以交给生物技术公司去做，最多6个月应该可以），然后用抗体-抗原亲和层析柱分离提纯。
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5楼2013-05-11 22:43:45
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不转录的DNA

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by yxncas-2012 at 2013-05-12 19:38:29
呵呵，感觉你对蛋白纯化这方面还是很懂的哈！...

不敢当！我只是做的多一点而已！
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7楼2013-05-12 19:39:55
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yxncas-2012

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
飘零的叶子(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-13 12:51:21
1、你这个pH变化比较大，有些蛋白的pI值在你透析液附近，产生沉淀；
2、你的盐浓度下降的也太快，没有一个梯度；
3、破菌后的上清杂质太多，可以选择进行硫酸铵分布沉淀的方式初步除杂，然后再用你想用的buffer进行复溶盐析沉淀！
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8楼2013-05-12 19:43:14
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不转录的DNA

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
飘零的叶子(gyesang代发): 金币+1, 鼓励跟贴交流！ 2013-05-13 12:51:43
引用回帖:
10楼: Originally posted by 飘零的叶子 at 2013-05-13 09:16:58
试过用不含NaCl的破碎缓冲液，透析中还是会出现浑浊，跟NaCl的浓度有关系吗？加NaCl是为了增加蛋白的溶解度的吧，我想确认一下这个问题...

是的，许多蛋白在有盐和没盐的情况下的溶解性是不一样的！

适当的增加NaCL的含量可以提到蛋白的溶解性和蛋白复性的产率！
我想可能你的蛋白是盐溶性蛋白吧！
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14楼2013-05-13 09:47:46
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不转录的DNA

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
飘零的叶子(gyesang代发): 金币+1, 鼓励跟贴交流！ 2013-05-13 12:52:01
引用回帖:
15楼: Originally posted by 飘零的叶子 at 2013-05-13 09:55:03
我用不含NaCl的破碎缓冲液与含NaCl的破碎缓冲液分别破碎菌体以后跑电泳做了对照，我的目的蛋白的含量没有太大的区别，但是用不含NaCl的的破碎缓冲液破碎以后再透析的时候还是会出现浑浊，这个沉淀中的蛋白应该是没 ...

你的沉淀，我也不知道还有木有活性！你怎么溶出来呢？一般的溶解方法可能溶解不出来了，你可能需要用Urea或盐酸胍溶解了！那就变性了！变性了，你还得复性！不建议你用沉淀！
因为你的蛋白是上清蛋白，你的蛋白有标签吗？先过一下Ni柱或GST柱吧！
如果没有标签，那就过一下离子柱吧！

一步纯化之后的蛋白纯度高点，可能蛋白之间相互作用减少点，沉淀的可能性小一点吧！！！！

再问一下：你的蛋白PI值多少？
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16楼2013-05-13 10:28:40
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不转录的DNA

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
飘零的叶子(gyesang代发): 金币+1, 鼓励跟贴交流！ 2013-05-13 12:52:20
引用回帖:
17楼: Originally posted by 飘零的叶子 at 2013-05-13 10:40:45
我的蛋白没有标签，破碎上清可以直接上离子柱吗？不需要除盐吗？我用软件预测的蛋白等电点是8.56，但是不知道它的的具体构象所以实际的等电点并不能确定...

哦  ！你的不除盐是不可以过离子柱的！！建议你：
先用硫酸铵分级沉淀初步纯化你的蛋白，是你的蛋白纯度更高点！！
再用脱盐柱G25脱盐试试！G25脱盐快速又方便！脱盐既是换buffer！
可以先取少量的脱盐试一试！看蛋白是否沉在柱子上！！
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18楼2013-05-13 11:04:21
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普通回帖

yxncas-2012

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 不转录的DNA at 2013-05-11 15:35:50
一般我们做蛋白先是破碎，再纯化，然后透析！
虽然不知道你破菌之后，透析蛋白用于干嘛？我猜可能是过阳离子柱是吧？
1）.因为你破碎之后，上清中是含有许多种类蛋白的，蛋白浓度越高，protein越容易Aggregated， ...

呵呵，感觉你对蛋白纯化这方面还是很懂的哈！
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6楼2013-05-12 19:38:29
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 不转录的DNA at 2013-05-11 15:35:50
一般我们做蛋白先是破碎，再纯化，然后透析！
虽然不知道你破菌之后，透析蛋白用于干嘛？我猜可能是过阳离子柱是吧？
1）.因为你破碎之后，上清中是含有许多种类蛋白的，蛋白浓度越高，protein越容易Aggregated， ...

透析是为了除盐，然后上阳离子柱，透析中沉淀下来的蛋白中确实是含有我的目的蛋白的，透析液中是不含NaCl的，我也试过用不含NaCl的破碎缓冲液进行破碎然后在不含NaCl的Tris-HCl的缓冲液中进行透析，还是会有浑浊出现。我想问沉淀下来的蛋白会不会变性？可不可以用缓冲液溶解以后继续上到阳离子柱呢？！
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9楼2013-05-13 09:15:40
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zhoupeng87 at 2013-05-11 15:50:59
是不是因为缓冲液是含0.5M NaCl

试过用不含NaCl的破碎缓冲液，透析中还是会出现浑浊，跟NaCl的浓度有关系吗？加NaCl是为了增加蛋白的溶解度的吧，我想确认一下这个问题
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10楼2013-05-13 09:16:58
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