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不转录的DNA

金虫 (小有名气)

MolEPI: 3
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专业: 蛋白质组学

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+5, MolEPI+1, 中肯的建议！ 2013-05-11 20:43:52
飘零的叶子: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-05-12 09:40:06

一般我们做蛋白先是破碎，再纯化，然后透析！
虽然不知道你破菌之后，透析蛋白用于干嘛？我猜可能是过阳离子柱是吧？
1）.因为你破碎之后，上清中是含有许多种类蛋白的，蛋白浓度越高，protein越容易Aggregated，然后形成沉淀！可能沉淀的并不是你的蛋白，而是杂蛋白！
我经常将一部纯化之后！的蛋白流出，放置在4度，第二天观察发现蛋白变浑浊了，离了心之后，分别取上清与沉淀电泳，结果显示我的蛋白仍在上清！

2）.通过透析换buffer来改变pH，可能会改变许多蛋白质的正确构象，使蛋白发生沉淀；也有可能是因为pH的改变刚好经过他的等电点，所以发生了沉淀！如果你的目的蛋白PI值在7.6~8.5之间，那么沉淀的可能是你的蛋白·····
3). 你的破碎buffer中含有500mM的盐，不知道你的透析buffer中含不含有？
总之，我也不知道你沉淀的蛋白是否是你的蛋白，你需要将其离心之后，分别取上清和沉淀跑一次SDS-PAGE！

你的方案得改进：
1. 最好在你的目的蛋白前加个标签，His或GST的。如果就只需要目的protein！！！那就在标签之后加个酶切位点吧！经过一步纯化之后，蛋白的浓度和纯度都会得到提高，一步纯化之后再透析不迟啊！
2.透析还是比较慢的，建议你用脱盐柱G25换你的buffer！
就这么多吧，希望能给你点建议！