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飘零的叶子

新虫 (小有名气)

[求助] 蛋白透析过程中出现浑浊

我的目的蛋白是胞内可溶表达，破菌后离心取上清，将破碎上清对ph7.6的Tris-HCl缓冲液进行透析，透析过程中透析袋内出现浑浊，破菌缓冲液是含0.5M NaCl的ph8.5的Tris-HCl溶液，哪位大侠知道为什么透析过程中为什么会出现浑浊，该如何改进实验方案？！
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1楼 2013-05-11 14:30:22
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yxncas-2012

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
飘零的叶子(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-13 12:51:21
1、你这个pH变化比较大，有些蛋白的pI值在你透析液附近，产生沉淀；
2、你的盐浓度下降的也太快，没有一个梯度；
3、破菌后的上清杂质太多，可以选择进行硫酸铵分布沉淀的方式初步除杂，然后再用你想用的buffer进行复溶盐析沉淀！
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8楼2013-05-12 19:43:14
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不转录的DNA

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+5, MolEPI+1, 中肯的建议！ 2013-05-11 20:43:52
飘零的叶子: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-05-12 09:40:06
一般我们做蛋白先是破碎，再纯化，然后透析！
虽然不知道你破菌之后，透析蛋白用于干嘛？我猜可能是过阳离子柱是吧？
1）.因为你破碎之后，上清中是含有许多种类蛋白的，蛋白浓度越高，protein越容易Aggregated，然后形成沉淀！可能沉淀的并不是你的蛋白，而是杂蛋白！
我经常将一部纯化之后！的蛋白流出，放置在4度，第二天观察发现蛋白变浑浊了，离了心之后，分别取上清与沉淀电泳，结果显示我的蛋白仍在上清！

2）.通过透析换buffer来改变pH，可能会改变许多蛋白质的正确构象，使蛋白发生沉淀；也有可能是因为pH的改变刚好经过他的等电点，所以发生了沉淀！如果你的目的蛋白PI值在7.6~8.5之间，那么沉淀的可能是你的蛋白·····
3). 你的破碎buffer中含有500mM的盐，不知道你的透析buffer中含不含有？
总之，我也不知道你沉淀的蛋白是否是你的蛋白，你需要将其离心之后，分别取上清和沉淀跑一次SDS-PAGE！

你的方案得改进：
1. 最好在你的目的蛋白前加个标签，His或GST的。如果就只需要目的protein！！！那就在标签之后加个酶切位点吧！经过一步纯化之后，蛋白的浓度和纯度都会得到提高，一步纯化之后再透析不迟啊！
2.透析还是比较慢的，建议你用脱盐柱G25换你的buffer！
就这么多吧，希望能给你点建议！
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长得比我英俊的，没我有才华！有才华的，没我长得俊！
2楼2013-05-11 15:35:50
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zhoupeng87

版主 (文学泰斗)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是不是因为缓冲液是含0.5M NaCl
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3楼2013-05-11 15:50:59
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草蔻年华

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
飘零的叶子(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-13 12:51:12
你的蛋白的等电点是多少，是不是蛋白析出了，可以调节透析液 的PH试试。
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4楼2013-05-11 20:44:17
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