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蛋白透析过程中出现浑浊
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| 我的目的蛋白是胞内可溶表达，破菌后离心取上清，将破碎上清对ph7.6的Tris-HCl缓冲液进行透析，透析过程中透析袋内出现浑浊，破菌缓冲液是含0.5M NaCl的ph8.5的Tris-HCl溶液，哪位大侠知道为什么透析过程中为什么会出现浑浊，该如何改进实验方案？！ |
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 分子生化实验经验积累 | 【分子生物】EPI帖 | 蛋白表达纯化与检测 |
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zhoupeng87
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3楼2013-05-11 15:50:59
【答案】应助回帖
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飘零的叶子: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-05-12 09:40:06
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一般我们做蛋白先是破碎，再纯化，然后透析！ 虽然不知道你破菌之后，透析蛋白用于干嘛？我猜可能是过阳离子柱是吧？ 1）.因为你破碎之后，上清中是含有许多种类蛋白的，蛋白浓度越高，protein越容易Aggregated，然后形成沉淀！可能沉淀的并不是你的蛋白，而是杂蛋白！ 我经常将一部纯化之后！的蛋白流出，放置在4度，第二天观察发现蛋白变浑浊了，离了心之后，分别取上清与沉淀电泳，结果显示我的蛋白仍在上清！ 2）.通过透析换buffer来改变pH，可能会改变许多蛋白质的正确构象，使蛋白发生沉淀；也有可能是因为pH的改变刚好经过他的等电点，所以发生了沉淀！如果你的目的蛋白PI值在7.6~8.5之间，那么沉淀的可能是你的蛋白····· 3). 你的破碎buffer中含有500mM的盐，不知道你的透析buffer中含不含有？ 总之，我也不知道你沉淀的蛋白是否是你的蛋白，你需要将其离心之后，分别取上清和沉淀跑一次SDS-PAGE！ 你的方案得改进： 1. 最好在你的目的蛋白前加个标签，His或GST的。如果就只需要目的protein！！！那就在标签之后加个酶切位点吧！经过一步纯化之后，蛋白的浓度和纯度都会得到提高，一步纯化之后再透析不迟啊！ 2.透析还是比较慢的，建议你用脱盐柱G25换你的buffer！ 就这么多吧，希望能给你点建议！ |
2楼2013-05-11 15:35:50
4楼2013-05-11 20:44:17
凌波丽
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【答案】应助回帖
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飘零的叶子(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-13 12:51:02
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飘零的叶子(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-13 12:51:02
| 液体浑浊就是其中的溶质的溶解度低，提高溶质的溶解度即可。让溶液pH离开蛋白质的pI，但是太酸或太碱，以免蛋白质变性，引起更多浑浊；另外，可能是其他的非目的的杂质太多了，离心、分级沉淀、层析分离出目的蛋白质，许多时候杂质不好去除，那么就想方设法把分离出目的蛋白质即可，最好的办法之一：亲和层析，可以用GST，(His)6标签，也可以不用。直接用目的蛋白质制备当克隆抗体（可以交给生物技术公司去做，最多6个月应该可以），然后用抗体-抗原亲和层析柱分离提纯。 |
5楼2013-05-11 22:43:45
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