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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蛋白透析过程中出现浑浊
汕头大学海洋科学接受调剂
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
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5楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-05-11 22:43:45
液体浑浊就是其中的溶质的溶解度低，提高溶质的溶解度即可。让溶液pH离开蛋白质的pI，但是太酸或太碱，以免蛋白质变性，引起更多浑浊；另外，可能是其他的非目的的杂质太多了，离心、分级沉淀、层析分离出目的蛋白质 ...

加标签是不可能了，只能在破碎还有透析这边改条件
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11楼2013-05-13 09:24:19
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
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4楼: Originally posted by 草蔻年华 at 2013-05-11 20:44:17
你的蛋白的等电点是多少，是不是蛋白析出了，可以调节透析液 的PH试试。

用软件预测的蛋白等电点是8.56，不知道这个准不准啊
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12楼2013-05-13 09:29:03
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
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8楼: Originally posted by yxncas-2012 at 2013-05-12 19:43:14
1、你这个pH变化比较大，有些蛋白的pI值在你透析液附近，产生沉淀；
2、你的盐浓度下降的也太快，没有一个梯度；
3、破菌后的上清杂质太多，可以选择进行硫酸铵分布沉淀的方式初步除杂，然后再用你想用的buffer进 ...

那如果透析的话透析缓冲液的ph与蛋白等电点相差0.5-1个ph应该就可以的吧
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13楼2013-05-13 09:34:49
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不转录的DNA

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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飘零的叶子(gyesang代发): 金币+1, 鼓励跟贴交流！ 2013-05-13 12:51:43
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10楼: Originally posted by 飘零的叶子 at 2013-05-13 09:16:58
试过用不含NaCl的破碎缓冲液，透析中还是会出现浑浊，跟NaCl的浓度有关系吗？加NaCl是为了增加蛋白的溶解度的吧，我想确认一下这个问题...

是的，许多蛋白在有盐和没盐的情况下的溶解性是不一样的！

适当的增加NaCL的含量可以提到蛋白的溶解性和蛋白复性的产率！
我想可能你的蛋白是盐溶性蛋白吧！
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长得比我英俊的，没我有才华！有才华的，没我长得俊！
14楼2013-05-13 09:47:46
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 不转录的DNA at 2013-05-13 09:47:46
是的，许多蛋白在有盐和没盐的情况下的溶解性是不一样的！

适当的增加NaCL的含量可以提到蛋白的溶解性和蛋白复性的产率！
我想可能你的蛋白是盐溶性蛋白吧！...

我用不含NaCl的破碎缓冲液与含NaCl的破碎缓冲液分别破碎菌体以后跑电泳做了对照，我的目的蛋白的含量没有太大的区别，但是用不含NaCl的的破碎缓冲液破碎以后再透析的时候还是会出现浑浊，这个沉淀中的蛋白应该是没有变性，还可以继续用的吧？！
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15楼2013-05-13 09:55:03
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不转录的DNA

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
飘零的叶子(gyesang代发): 金币+1, 鼓励跟贴交流！ 2013-05-13 12:52:01
引用回帖:
15楼: Originally posted by 飘零的叶子 at 2013-05-13 09:55:03
我用不含NaCl的破碎缓冲液与含NaCl的破碎缓冲液分别破碎菌体以后跑电泳做了对照，我的目的蛋白的含量没有太大的区别，但是用不含NaCl的的破碎缓冲液破碎以后再透析的时候还是会出现浑浊，这个沉淀中的蛋白应该是没 ...

你的沉淀，我也不知道还有木有活性！你怎么溶出来呢？一般的溶解方法可能溶解不出来了，你可能需要用Urea或盐酸胍溶解了！那就变性了！变性了，你还得复性！不建议你用沉淀！
因为你的蛋白是上清蛋白，你的蛋白有标签吗？先过一下Ni柱或GST柱吧！
如果没有标签，那就过一下离子柱吧！

一步纯化之后的蛋白纯度高点，可能蛋白之间相互作用减少点，沉淀的可能性小一点吧！！！！

再问一下：你的蛋白PI值多少？
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长得比我英俊的，没我有才华！有才华的，没我长得俊！
16楼2013-05-13 10:28:40
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 不转录的DNA at 2013-05-13 10:28:40
你的沉淀，我也不知道还有木有活性！你怎么溶出来呢？一般的溶解方法可能溶解不出来了，你可能需要用Urea或盐酸胍溶解了！那就变性了！变性了，你还得复性！不建议你用沉淀！
因为你的蛋白是上清蛋白，你的蛋白有 ...

我的蛋白没有标签，破碎上清可以直接上离子柱吗？不需要除盐吗？我用软件预测的蛋白等电点是8.56，但是不知道它的的具体构象所以实际的等电点并不能确定
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17楼2013-05-13 10:40:45
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不转录的DNA

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
飘零的叶子(gyesang代发): 金币+1, 鼓励跟贴交流！ 2013-05-13 12:52:20
引用回帖:
17楼: Originally posted by 飘零的叶子 at 2013-05-13 10:40:45
我的蛋白没有标签，破碎上清可以直接上离子柱吗？不需要除盐吗？我用软件预测的蛋白等电点是8.56，但是不知道它的的具体构象所以实际的等电点并不能确定...

哦  ！你的不除盐是不可以过离子柱的！！建议你：
先用硫酸铵分级沉淀初步纯化你的蛋白，是你的蛋白纯度更高点！！
再用脱盐柱G25脱盐试试！G25脱盐快速又方便！脱盐既是换buffer！
可以先取少量的脱盐试一试！看蛋白是否沉在柱子上！！
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长得比我英俊的，没我有才华！有才华的，没我长得俊！
18楼2013-05-13 11:04:21
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baicai1487

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by 不转录的DNA at 2013-05-13 11:04:21
哦  ！你的不除盐是不可以过离子柱的！！建议你：
先用硫酸铵分级沉淀初步纯化你的蛋白，是你的蛋白纯度更高点！！
再用脱盐柱G25脱盐试试！G25脱盐快速又方便！脱盐既是换buffer！
可以先取少量的脱盐试一试！ ...

您好！蛋白高手，能否问您一个问题，就是我用PBS提的一个总蛋白，硫酸铵沉淀，再用PBS透析除盐，最后用G25分离柱除小分子化合物，还是用PBS做流动相，不知可行否？蛋白过了G25分离柱之后，盐都除掉了，相当于得到蛋白水溶液，这样的蛋白稳定吗？
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19楼2013-11-28 10:47:13
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