24小时热门版块排行榜    

查看: 4469  |  回复: 18
本帖产生 1 个 MolEPI ,点击这里进行查看

飘零的叶子

新虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-05-11 22:43:45
液体浑浊就是其中的溶质的溶解度低,提高溶质的溶解度即可。让溶液pH离开蛋白质的pI,但是太酸或太碱,以免蛋白质变性,引起更多浑浊;另外,可能是其他的非目的的杂质太多了,离心、分级沉淀、层析分离出目的蛋白质 ...

加标签是不可能了,只能在破碎还有透析这边改条件
11楼2013-05-13 09:24:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

飘零的叶子

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 草蔻年华 at 2013-05-11 20:44:17
你的蛋白的等电点是多少,是不是蛋白析出了,可以调节透析液 的PH试试。

用软件预测的蛋白等电点是8.56,不知道这个准不准啊
12楼2013-05-13 09:29:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

飘零的叶子

新虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by yxncas-2012 at 2013-05-12 19:43:14
1、你这个pH变化比较大,有些蛋白的pI值在你透析液附近,产生沉淀;
2、你的盐浓度下降的也太快,没有一个梯度;
3、破菌后的上清杂质太多,可以选择进行硫酸铵分布沉淀的方式初步除杂,然后再用你想用的buffer进 ...

那如果透析的话透析缓冲液的ph与蛋白等电点相差0.5-1个ph应该就可以的吧
13楼2013-05-13 09:34:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

不转录的DNA

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
飘零的叶子(gyesang代发): 金币+1, 鼓励跟贴交流! 2013-05-13 12:51:43
引用回帖:
10楼: Originally posted by 飘零的叶子 at 2013-05-13 09:16:58
试过用不含NaCl的破碎缓冲液,透析中还是会出现浑浊,跟NaCl的浓度有关系吗?加NaCl是为了增加蛋白的溶解度的吧,我想确认一下这个问题...

是的,许多蛋白在有盐和没盐的情况下的溶解性是不一样的!

适当的增加NaCL的含量可以提到蛋白的溶解性和蛋白复性的产率!
我想可能你的蛋白是盐溶性蛋白吧!
长得比我英俊的,没我有才华!有才华的,没我长得俊!
14楼2013-05-13 09:47:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

飘零的叶子

新虫 (小有名气)

引用回帖:
14楼: Originally posted by 不转录的DNA at 2013-05-13 09:47:46
是的,许多蛋白在有盐和没盐的情况下的溶解性是不一样的!

适当的增加NaCL的含量可以提到蛋白的溶解性和蛋白复性的产率!
我想可能你的蛋白是盐溶性蛋白吧!...

我用不含NaCl的破碎缓冲液与含NaCl的破碎缓冲液分别破碎菌体以后跑电泳做了对照,我的目的蛋白的含量没有太大的区别,但是用不含NaCl的的破碎缓冲液破碎以后再透析的时候还是会出现浑浊,这个沉淀中的蛋白应该是没有变性,还可以继续用的吧?!
15楼2013-05-13 09:55:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

不转录的DNA

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


飘零的叶子(gyesang代发): 金币+1, 鼓励跟贴交流! 2013-05-13 12:52:01
引用回帖:
15楼: Originally posted by 飘零的叶子 at 2013-05-13 09:55:03
我用不含NaCl的破碎缓冲液与含NaCl的破碎缓冲液分别破碎菌体以后跑电泳做了对照,我的目的蛋白的含量没有太大的区别,但是用不含NaCl的的破碎缓冲液破碎以后再透析的时候还是会出现浑浊,这个沉淀中的蛋白应该是没 ...

你的沉淀,我也不知道还有木有活性!你怎么溶出来呢?一般的溶解方法可能溶解不出来了,你可能需要用Urea或盐酸胍溶解了!那就变性了!变性了,你还得复性!不建议你用沉淀!
因为你的蛋白是上清蛋白,你的蛋白有标签吗?先过一下Ni柱或GST柱吧!
如果没有标签,那就过一下离子柱吧!

一步纯化之后的蛋白纯度高点,可能蛋白之间相互作用减少点,沉淀的可能性小一点吧!!!!

再问一下:你的蛋白PI值多少?
长得比我英俊的,没我有才华!有才华的,没我长得俊!
16楼2013-05-13 10:28:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

飘零的叶子

新虫 (小有名气)

引用回帖:
16楼: Originally posted by 不转录的DNA at 2013-05-13 10:28:40
你的沉淀,我也不知道还有木有活性!你怎么溶出来呢?一般的溶解方法可能溶解不出来了,你可能需要用Urea或盐酸胍溶解了!那就变性了!变性了,你还得复性!不建议你用沉淀!
因为你的蛋白是上清蛋白,你的蛋白有 ...

我的蛋白没有标签,破碎上清可以直接上离子柱吗?不需要除盐吗?我用软件预测的蛋白等电点是8.56,但是不知道它的的具体构象所以实际的等电点并不能确定
17楼2013-05-13 10:40:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

不转录的DNA

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


飘零的叶子(gyesang代发): 金币+1, 鼓励跟贴交流! 2013-05-13 12:52:20
引用回帖:
17楼: Originally posted by 飘零的叶子 at 2013-05-13 10:40:45
我的蛋白没有标签,破碎上清可以直接上离子柱吗?不需要除盐吗?我用软件预测的蛋白等电点是8.56,但是不知道它的的具体构象所以实际的等电点并不能确定...

哦  !你的不除盐是不可以过离子柱的!!建议你:
先用硫酸铵分级沉淀初步纯化你的蛋白,是你的蛋白纯度更高点!!
再用脱盐柱G25脱盐试试!G25脱盐快速又方便!脱盐既是换buffer!
可以先取少量的脱盐试一试!看蛋白是否沉在柱子上!!
长得比我英俊的,没我有才华!有才华的,没我长得俊!
18楼2013-05-13 11:04:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

baicai1487

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
18楼: Originally posted by 不转录的DNA at 2013-05-13 11:04:21
哦  !你的不除盐是不可以过离子柱的!!建议你:
先用硫酸铵分级沉淀初步纯化你的蛋白,是你的蛋白纯度更高点!!
再用脱盐柱G25脱盐试试!G25脱盐快速又方便!脱盐既是换buffer!
可以先取少量的脱盐试一试! ...

您好!蛋白高手,能否问您一个问题,就是我用PBS提的一个总蛋白,硫酸铵沉淀,再用PBS透析除盐,最后用G25分离柱除小分子化合物,还是用PBS做流动相,不知可行否?蛋白过了G25分离柱之后,盐都除掉了,相当于得到蛋白水溶液,这样的蛋白稳定吗?
19楼2013-11-28 10:47:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 飘零的叶子 的主题更新
信息提示
请填处理意见