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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 切胶回收过程有可能对DNA造成损伤吗？
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lulushuo

铁虫 (初入文坛)

[求助] 切胶回收过程有可能对DNA造成损伤吗？

Sample Text
最近的实验遇到了一个很怪的问题，我对载体pAcGFP1进行线性化PCR，然后切胶回收，用的是QIAGEN胶回收试剂盒，200ul的PCR体系，40ul EB洗脱后，浓度在110ng/ul左右，电泳验证也没有问题。但是当我对其高温加热时，也就是只加buffer和水，放入PCR仪，运行PCR程序，5个循环，约30min，再跑电泳，回收产物就变成弥散状态，没有主带；我用乙醇沉淀回收的PCR产物，做同样实验，DNA就会稳定存在。请问各位分子高手，是切胶回收过程对DNA造成损伤了吗？导致其在高温下不稳定？有没有遇到同样情况的同学啊？帮忙分析一下啊~~跪求！！

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1楼2013-05-06 12:04:34
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★
lulushuo(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-07 00:55:00
引用回帖:
6楼: Originally posted by lulushuo at 2013-05-06 12:47:32
谢谢1楼如此细致的分析！但确实是理解错了，我只是运行PCR程序，不做PCR，因为我之前用这个胶回收的线性化载体做PCR时持续失败，所以就开始找原因，做个这个实验，发现是其在PCR条件下自身不稳定，所以就开始怀疑是 ...

从凝胶中回收DNA导致DNA损伤，最可能是高速离心产生的机械力，因为DNA混有凝胶颗粒，离心时可能对于线性DNA产生剪切力，切断DNA。可以尽量捣碎凝胶，另外适当降低离心的速度，增加离心次数，取上清液后过滤一下再去离心。
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8楼2013-05-06 13:04:01
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香。期待你的慷慨解囊。快乐每一天 2013-05-06 14:45:17
你的PCR结果电泳弥散，可能是非特异性扩增多，即出现非特异性扩增带。也就是：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。
非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过低、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关（过多一般是超过25次循环，你只循环5次应该没有问题）。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。
其对策有：首先可以提高镁离子的浓度， 由1.0mmol/L起以0.05mmol/L为单位逐渐上升，最高不超过10.0mmol/L。提高镁离子的浓度无效的话，调整引物浓度（你的PCR结果电泳拖尾，可能是非特异性扩增多，因此应适当降低引物浓度），适当增加模板量，减少循环次 数。减低酶量或调换另一来源的酶。适当提高退火温度。以上都不行则要重新设计引物。每种调整均可以分梯度进行。
切胶回收一般如果剪切力不大的话，一般不会引起DNA断裂。
另外可能是PCR实验时发生了污染。污染原因：
　　　(一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。
　　　(二)PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.
　　　(三)PCR扩增产物污染:这是PCR反应中最主要最常见的污染问题，因为PCR产物拷贝量 大，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可造成假阳就可形成假阳性。
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2楼2013-05-06 12:22:11
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
2楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-05-06 12:22:11
你的PCR结果电泳弥散，可能是非特异性扩增多，即出现非特异性扩增带。也就是：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。
非特异性条带的出现，其原因：一是 ...

楼上，楼主不是做PCR啊，Ta只是加了buffer和水，然后跑了5个cycle，电泳出现弥散，所以不存在非特异扩增的问题啊
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
3楼2013-05-06 12:27:31
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
★
myprayer: 金币+1, 真的很感激你。。。。。 2013-05-06 14:45:52
"但是当我对其高温加热时，也就是只加buffer和水，放入PCR仪，运行PCR程序，5个循环，约30min，再跑电泳，回收产物就变成弥散状态，没有主带；"-----------如果不是PCR，那这是什么操作那？我理解错了？
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4楼2013-05-06 12:34:18
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