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lulushuo

铁虫 (初入文坛)

[求助] 切胶回收过程有可能对DNA造成损伤吗?

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最近的实验遇到了一个很怪的问题,我对载体pAcGFP1进行线性化PCR,然后切胶回收,用的是QIAGEN胶回收试剂盒,200ul的PCR体系,40ul EB洗脱后,浓度在110ng/ul左右,电泳验证也没有问题。但是当我对其高温加热时,也就是只加buffer和水,放入PCR仪,运行PCR程序,5个循环,约30min,再跑电泳,回收产物就变成弥散状态,没有主带;我用乙醇沉淀回收的PCR产物,做同样实验,DNA就会稳定存在。请问各位分子高手,是切胶回收过程对DNA造成损伤了吗?导致其在高温下不稳定?有没有遇到同样情况的同学啊?帮忙分析一下啊~~跪求!!

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lulushuo

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-05-06 12:34:18
"但是当我对其高温加热时,也就是只加buffer和水,放入PCR仪,运行PCR程序,5个循环,约30min,再跑电泳,回收产物就变成弥散状态,没有主带;"-----------如果不是PCR,那这是什么操作那?我理解错了?

谢谢1楼如此细致的分析!但确实是理解错了,我只是运行PCR程序,不做PCR,因为我之前用这个胶回收的线性化载体做PCR时持续失败,所以就开始找原因,做个这个实验,发现是其在PCR条件下自身不稳定,所以就开始怀疑是切胶回收的过程出现了问题。只是想知道切胶回收的过程是否会对DNA造成损伤,有哪些环节可能造成这个损伤。。。
6楼2013-05-06 12:47:32
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