| 查看: 3954 | 回复: 9 | ||||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||||
[求助]
切胶回收过程有可能对DNA造成损伤吗？
|
||||
|
Sample Text 最近的实验遇到了一个很怪的问题，我对载体pAcGFP1进行线性化PCR，然后切胶回收，用的是QIAGEN胶回收试剂盒，200ul的PCR体系，40ul EB洗脱后，浓度在110ng/ul左右，电泳验证也没有问题。但是当我对其高温加热时，也就是只加buffer和水，放入PCR仪，运行PCR程序，5个循环，约30min，再跑电泳，回收产物就变成弥散状态，没有主带；我用乙醇沉淀回收的PCR产物，做同样实验，DNA就会稳定存在。请问各位分子高手，是切胶回收过程对DNA造成损伤了吗？导致其在高温下不稳定？有没有遇到同样情况的同学啊？帮忙分析一下啊~~跪求！！  1.png |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有172人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 双酶切后切胶回收
已经有34人回复
- DNA非变性PAGE胶 回收条带 二次PCR出现问题 急！！！
已经有6人回复
- 各种综合问题：酶切 胶回收 质粒浓缩 测浓度
已经有7人回复
- 构建基因文库（sauA酶切后胶回收 效率低 该怎么办
已经有14人回复
- 目的基因片段胶回收后酶切，然后再跑胶后发现条带很弱，怎么改进（求助）
已经有8人回复
- 哪位好心人给我讲讲DGGE后切胶回收、连接、转化、克隆到测序的过程？？
已经有7人回复
- 蛋白切胶回收如何操作？
已经有12人回复
- 从琼脂糖凝胶中回收DNA
已经有14人回复
- 如何在紫外灯下切胶
已经有13人回复
- 请教PCR产物酶切后是否可以直接过柱纯化而不胶回收？
已经有15人回复
- 切胶回收后片段不单一的原因
已经有12人回复
- dna切胶回收中各试剂的作用
已经有14人回复
- 关于DNA胶回收和酶切后回收的问题，诚请指导
已经有9人回复
- PCR产物凝胶回收、酶切等问题请教
已经有7人回复
- PCR产物回收之后跑胶浓度过低
已经有17人回复
- 关于切胶回收后有质粒污染和拼接PCR涂抹装条带的问题，有点长，呵呵
已经有13人回复
- 求助！切胶回收蛋白的方法
已经有9人回复
- 在基因重组过程中，怎样鉴别质粒载体是否被限制性内切酶切好？
已经有10人回复
- 【求助/交流】PCR产物切胶回收后可不可以加A尾,做TA克隆，急！希望高手们能帮帮忙！
已经有9人回复
- 【求助/交流】DNA琼脂糖凝胶回收，为什么回收率太低！
已经有53人回复
凌波丽
专家顾问 (知名作家)
-
专家经验: +218 - MolEPI: 44
- 应助: 397 (硕士)
- 贵宾: 0.044
- 金币: 2118.9
- 散金: 10
- 红花: 208
- 帖子: 5633
- 在线: 571.6小时
- 虫号: 1766465
- 注册: 2012-04-19
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
- 管辖: 生物科学综合
5楼2013-05-06 12:41:09
凌波丽
专家顾问 (知名作家)
-
专家经验: +218 - MolEPI: 44
- 应助: 397 (硕士)
- 贵宾: 0.044
- 金币: 2118.9
- 散金: 10
- 红花: 208
- 帖子: 5633
- 在线: 571.6小时
- 虫号: 1766465
- 注册: 2012-04-19
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
- 管辖: 生物科学综合
【答案】应助回帖
★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香。期待你的慷慨解囊。快乐每一天 2013-05-06 14:45:17
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香。期待你的慷慨解囊。快乐每一天 2013-05-06 14:45:17
|
你的PCR结果电泳弥散，可能是非特异性扩增多，即出现非特异性扩增带。也就是：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。 非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过低、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关（过多一般是超过25次循环，你只循环5次应该没有问题）。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。 其对策有：首先可以提高镁离子的浓度， 由1.0mmol/L起以0.05mmol/L为单位逐渐上升，最高不超过10.0mmol/L。提高镁离子的浓度无效的话，调整引物浓度（你的PCR结果电泳拖尾，可能是非特异性扩增多，因此应适当降低引物浓度），适当增加模板量，减少循环次 数。减低酶量或调换另一来源的酶。适当提高退火温度。以上都不行则要重新设计引物。每种调整均可以分梯度进行。 切胶回收一般如果剪切力不大的话，一般不会引起DNA断裂。 另外可能是PCR实验时发生了污染。污染原因： (一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。 (二)PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染. (三)PCR扩增产物污染:这是PCR反应中最主要最常见的污染问题，因为PCR产物拷贝量 大，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可造成假阳就可形成假阳性。 |
2楼2013-05-06 12:22:11
gyesang
荣誉版主 (著名写手)
-
专家经验: +24 - MolEPI: 31
- 应助: 599 (博士)
- 贵宾: 2.689
- 金币: 24334.9
- 散金: 1088
- 红花: 88
- 沙发: 2
- 帖子: 2327
- 在线: 623.1小时
- 虫号: 849017
- 注册: 2009-09-16
- 性别: GG
- 专业: 细胞信号转导
- 管辖: 分子生物
3楼2013-05-06 12:27:31
凌波丽
专家顾问 (知名作家)
-
专家经验: +218 - MolEPI: 44
- 应助: 397 (硕士)
- 贵宾: 0.044
- 金币: 2118.9
- 散金: 10
- 红花: 208
- 帖子: 5633
- 在线: 571.6小时
- 虫号: 1766465
- 注册: 2012-04-19
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
- 管辖: 生物科学综合
4楼2013-05-06 12:34:18
10