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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 第一次做蓝白斑筛选，培养12h后无斑
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)

[求助] 第一次做蓝白斑筛选，培养12h后无斑

如题，第一次做蓝白斑筛选，感觉问题挺多的，中午12点拿去培养，晚上12点看了好像都没长，一个篮斑都没有，白斑也没有，有的也只是几个气泡，看上去像白斑而已。。。
      本来昨天晚上做涂布的，但是培养基瓶子被人不小心弄破了，只好今天上午再做，所以含有目的片段的DH5a感受态细胞放在-20℃了一晚，用时冰上溶解再涂布的，这样会对细菌的活性有影响吗？
       我的IPTG（100mg/mL）、Amp（100mg/mL）及X-Gal（20mg/mL）是新配的，但是x-gal一开始我习惯性地加水来溶，发现不溶才顿觉自己溶剂加错了，然后取沉在管底的x-gal粉末加二甲基甲酰胺来溶，自己不知道这样是不是会影响很大，但是想既然一切都准备就绪了，就做了几个平板试试看
     一个对照（ddH2O 200ul ）；一个用自己新配的的X-Gal（200ul菌液涂布）；一个用以前师姐配的x-gal（不确定是否失效）200ul菌液涂布；
      AMp在倒板前加入，后就涂8ul IPTG，然后40ul X-Gal，最后菌液200ul，都是在酒精灯旁操作的，当稍微倾斜培养基，看到培养基表面液体不流动时放在37℃培养箱中，倒置培养。
     刚看了下，都没长的样子。。。
     刚看了些帖，越发睡不着，是不是我涂菌液时来回次数多，把细胞压死了，细胞都死了，所以长不起来了？？或者我Amp（终浓度100ug/ml,可能实际浓度比这个稍大些）加了有点多？？还是x-Gal有问题会影响很大？难道x-Gal有问题会抑制细菌生长？
     求各位大侠指点！！

[ Last edited by lmcyjxs on 2013-5-5 at 01:20 ]
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思路决定出路。。。
1楼 2013-05-05 01:18:03
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物版块期待你的更多精彩。还请多多指点哇 2013-05-05 10:29:08
lmcyjxs: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-05-06 09:43:14
你的蓝白斑都没有应该是菌的问题。你指的是做完熱激、复苏的菌液放在-20°C了？还是说没做熱激前冻在-20°C了？感受态也不能反复冻融。有可能菌被冻死了吧。复苏的感受态如果不能马上涂板，可以放在4°C，第二天再涂还是有活性的，超过三天就不好了。
涂布也不用特别小心，只要不是特别用力，一般菌也不会被压死。
此外，做转化需要做好对照。蓝白斑筛选需要做空载体的对照，应该全部是蓝斑，说明筛选药品没问题和感受态细胞有活性。还需要有负对照，就是感受态细胞不加目的DNA，涂抗性板应该什么都不长，说明感受态没有污染，抗性板的筛选压力足够。
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2楼2013-05-05 02:21:24
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-05 02:21:24
你的蓝白斑都没有应该是菌的问题。你指的是做完熱激、复苏的菌液放在-20°C了？还是说没做熱激前冻在-20°C了？感受态也不能反复冻融。有可能菌被冻死了吧。复苏的感受态如果不能马上涂板，可以放在4°C，第二天再涂 ...

谢谢cicelyzh的热心帮助！
   我的连接液放了-20℃了一晚，做完熱激、复苏的菌液也放在了-20°C一晚。
   是不是复苏后的感受态马上涂布会好些啊？如果冻在-20℃，是不是先在37℃保温下为好？
   我没做空载体对照，培养18h后我发现只长白斑了，有点微透明的那种，有小枪头尖那么大，有做用ddH2O涂在含抗性的培养基上，阴性对照什么东西都不长，说明另那两个板长出来的应该是含抗性的目的片段吧？
   怎么会不长蓝斑呢？我都不相信会有那么顺利就给我连上转化出来了呢！
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思路决定出路。。。
3楼2013-05-06 09:42:46
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
lmcyjxs(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-07 00:50:48
lmcyjxs: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-05-07 08:33:55
引用回帖:
3楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-05-06 09:42:46
谢谢cicelyzh的热心帮助！
   我的连接液放了-20℃了一晚，做完熱激、复苏的菌液也放在了-20°C一晚。
   是不是复苏后的感受态马上涂布会好些啊？如果冻在-20℃，是不是先在37℃保温下为好？
   我没做空载体对 ...

复苏后直接涂板。非要放的话在4°C。-20°C不适合保存活体菌，除非加了15%左右的甘油。偶尔也会出现只长白斑的情况，但不排除药品的问题。所以你需要做一个空载体对照，只有蓝斑的。
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4楼2013-05-07 00:42:55
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-07 00:42:55
复苏后直接涂板。非要放的话在4°C。-20°C不适合保存活体菌，除非加了15%左右的甘油。偶尔也会出现只长白斑的情况，但不排除药品的问题。所以你需要做一个空载体对照，只有蓝斑的。...

嗯，谢谢！想问下菌液保存是不是离心后弃培养液，加15%左右的甘油就好了啊？
还有做空载体对照，一般加多少涂布比较合适啊？
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思路决定出路。。。
5楼2013-05-07 08:33:31
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-07 00:42:55
复苏后直接涂板。非要放的话在4°C。-20°C不适合保存活体菌，除非加了15%左右的甘油。偶尔也会出现只长白斑的情况，但不排除药品的问题。所以你需要做一个空载体对照，只有蓝斑的。...

还有就是，我把复苏后的细胞上次涂布之后就放在了-20℃保存了，是不是应该转到4℃为好啊？
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6楼2013-05-07 08:38:10
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
lmcyjxs(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-08 02:08:49
lmcyjxs: 金币+1, ★★★很有帮助 2013-05-10 11:54:47
引用回帖:
6楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-05-07 08:38:10
还有就是，我把复苏后的细胞上次涂布之后就放在了-20℃保存了，是不是应该转到4℃为好啊？...

保存菌液一般是直接在菌液里加灭菌甘油至终浓度为15%的。一般只限于保种，很少有人去保存热激、复苏的菌液。做转化不需要很长时间，一般都是做完直接涂板。我做转化是用自己做的感受态细胞，50μl，加350μlLB复苏，涂50-100μl。剩余的放在4°C。4°C本身对菌的活性有一定影响，但是有时候第一次涂布菌量不合适，可以第二天再次涂板。
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7楼2013-05-07 22:44:45
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-07 22:44:45
保存菌液一般是直接在菌液里加灭菌甘油至终浓度为15%的。一般只限于保种，很少有人去保存热激、复苏的菌液。做转化不需要很长时间，一般都是做完直接涂板。我做转化是用自己做的感受态细胞，50μl，加350μlLB复苏 ...

谢谢
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8楼2013-05-10 11:54:12
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running113

木虫 (著名写手)
不知楼主冷冻的时候有没有加甘油（抗冷冻剂）。
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SCI我来了！！！
9楼2013-06-14 11:40:49
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by running113 at 2013-06-14 11:40:49
不知楼主冷冻的时候有没有加甘油（抗冷冻剂）。

没有，后来长了7、8个斑，是阳性克隆，你说的是感受态细胞有无加甘油吗？
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10楼2013-06-14 15:33:10
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