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lmcyjxs金虫 (正式写手)
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第一次做蓝白斑筛选，培养12h后无斑
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如题，第一次做蓝白斑筛选，感觉问题挺多的，中午12点拿去培养，晚上12点看了好像都没长，一个篮斑都没有，白斑也没有，有的也只是几个气泡，看上去像白斑而已。。。 本来昨天晚上做涂布的，但是培养基瓶子被人不小心弄破了，只好今天上午再做，所以含有目的片段的DH5a感受态细胞放在-20℃了一晚，用时冰上溶解再涂布的，这样会对细菌的活性有影响吗？ 我的IPTG（100mg/mL）、Amp（100mg/mL）及X-Gal（20mg/mL）是新配的，但是x-gal一开始我习惯性地加水来溶，发现不溶才顿觉自己溶剂加错了，然后取沉在管底的x-gal粉末加二甲基甲酰胺来溶，自己不知道这样是不是会影响很大，但是想既然一切都准备就绪了，就做了几个平板试试看 一个对照（ddH2O 200ul ）；一个用自己新配的的X-Gal（200ul菌液涂布）；一个用以前师姐配的x-gal（不确定是否失效）200ul菌液涂布； AMp在倒板前加入，后就涂8ul IPTG，然后40ul X-Gal，最后菌液200ul，都是在酒精灯旁操作的，当稍微倾斜培养基，看到培养基表面液体不流动时放在37℃培养箱中，倒置培养。 刚看了下，都没长的样子。。。 刚看了些帖，越发睡不着，是不是我涂菌液时来回次数多，把细胞压死了，细胞都死了，所以长不起来了？？或者我Amp（终浓度100ug/ml,可能实际浓度比这个稍大些）加了有点多？？还是x-Gal有问题会影响很大？难道x-Gal有问题会抑制细菌生长？ 求各位大侠指点！！ [ Last edited by lmcyjxs on 2013-5-5 at 01:20 ] |
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lmcyjxs
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你的蓝白斑都没有应该是菌的问题。你指的是做完熱激、复苏的菌液放在-20°C了？还是说没做熱激前冻在-20°C了？感受态也不能反复冻融。有可能菌被冻死了吧。复苏的感受态如果不能马上涂板，可以放在4°C，第二天再涂还是有活性的，超过三天就不好了。 涂布也不用特别小心，只要不是特别用力，一般菌也不会被压死。 此外，做转化需要做好对照。蓝白斑筛选需要做空载体的对照，应该全部是蓝斑，说明筛选药品没问题和感受态细胞有活性。还需要有负对照，就是感受态细胞不加目的DNA，涂抗性板应该什么都不长，说明感受态没有污染，抗性板的筛选压力足够。 |
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lmcyjxs
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