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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 重组蛋白表达
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echochen1017

新虫 (初入文坛)

[求助] 重组蛋白表达

前段时间突变了一段基因，测序完成，现在需要从T载体上酶切下来后，连到pET28上，kan抗性筛选。使用的提质粒试剂盒是康为世纪的，酶切的酶用的是takara家定的，但是这么做了一个月，一个抗性筛选的都没成功，想求助是哪个环节出错了。
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1楼 2013-04-26 08:35:22
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tianyinghu

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
echochen1017(gyesang代发): 金币+1, 鼓励应助！ 2013-04-26 22:27:33
echochen1017: 金币+1, ★有帮助 2013-04-27 11:12:00
搞不明白，你们学生干吗要用T载体做中转，为什么不直接装PET-28呢，
第一：片段回收下来有没有测浓度或者跑电泳看下。是否回收丢了。如果回收丢了的话那就是试剂盒的问题了。
第二：载体有没有做空白对照，这样检测你的载体是否切好。这样也可以检测是否是你后面筛选出问题了。
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4楼2013-04-26 08:58:18
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小科研女dow

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
echochen1017(gyesang代发): 金币+1, 鼓励发贴交流，为楼主问题解决提供可能的线索！ 2013-04-26 22:27:19
可以试试重新PCR一遍 然后再酶切 再连接
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做出色的科研人
2楼2013-04-26 08:51:03
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
echochen1017(gyesang代发): 金币+1, 鼓励应助！ 2013-04-26 22:27:45
重新酶切，根据质粒用量和酶活性使用酶，确保完全切开。回收后定量，按比例连接，转化时做好正负对照，应该不会出问题。
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5楼2013-04-26 09:08:51
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panyuzhu

禁虫 (小有名气)
★
感谢参与，应助指数 +1
echochen1017(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-04-26 22:27:58
gyesang: 回帖置顶 2013-04-26 22:28:00
本帖内容被屏蔽
6楼2013-04-26 20:23:33
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