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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酶切、连接和转化
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374695805

新虫 (初入文坛)

[求助] 酶切、连接和转化

(1)双酶切( HindIII & NdeI )表达载体pET-28a(+)时，双酶切产物纯化后未经T4 Ligase连接居然还能转化成功,是什么原因？酶切体系如下(25微升)：酶切缓冲液(1*K):2.5; pET28a(+):20; HindIII酶液:1; NdeI:1; 无菌超纯水:0.5.
(2)载体自连的原理是什么？是载体经双酶切后剩余的部分连接还是双酶切中一个内切酶活性较低没有切开，切开的那端又重新连回原处？
(3)经单酶切的表达载体pET-28a(+)能转化至大肠杆菌体内吗？一定要是环状闭合共价的质粒(cccDNA)才能导入细胞吗？
(4)电转化前要对连接产物中的重组DNA进行洗涤沉淀，但连接产物体系为20微升，重组DNA无法用肉眼观察，如何在弃去上清的时候防止重组DNA也一并被弃去？
求各位高手指教！不甚感激！
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1楼 2013-04-23 12:33:18
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-10-29 18:32:47
引用回帖:
6楼: Originally posted by 374695805 at 2013-04-25 13:29:07
(1)  是胶回收。有必要分布酶切提高酶切效率吗？
(2)  连接产物不纯化直接电转化，会打坏电转杯或者基因导入座的吧？如果是氯化钙转化是可以直接转化的，无需纯化。...

1. 一般没有必要分步酶切。如果控制好DNA量和酶的用量应该可以切完全的。
2. 通常直接在40μl感受态里加不超过2μl的连接产物 （不超过5%），电转化完全没有问题。
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10楼2013-10-22 01:47:31
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+3, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-04-23 20:03:44
374695805: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-04-25 13:26:34
(1) 说明酶切不完全，有质粒没有切开，或者只切了一条链。你酶切后是切胶回收的吗？
(2) 是这么回事。
(3) 线状分子也可以转化大肠杆菌，只是转化效率要低很多。
(4) 电转化体系里盐会造成电弧，所以一般是用小于感受态细胞5%体积的连接产物不纯化直接转化的。
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3楼2013-04-23 14:45:00
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panyuzhu

禁虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-04-23 20:03:50
374695805: 金币+2 2013-04-25 13:29:29
本帖内容被屏蔽
4楼2013-04-23 16:50:14
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酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-04-24 20:24:27
酶切时，要注意DNA的量以及酶的用量。由于不同的酶的活性单位定义是不一样的，酶切时两种酶的用量通常也不一样。你的酶切体系中，用了20ul的DNA，你的质粒定量了（浓度知道吗？）？一般来说，一个简单的克隆，载体酶切时，用1---2ug的质粒就足够了，因为用回收的载体连接时，只需要50--100ng的酶切后的载体DNA就足够了。
太多的载体DNA可能导致质粒酶切不完全，就会出现你描述的情况1.
为了保证载体和PCR产物的完全酶切，我建议你用double digestion designer （http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/showresult.php）来设计你的双酶切，可以精确计算酶切所需的酶量，还能根据酶的供应商来推荐最合适的buffer，确保酶切完全，有效减少克隆时的背景克隆，从而提高克隆成功率。
祝好运！
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5楼2013-04-23 22:07:24
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