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酶切、连接和转化
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(1)双酶切( HindIII & NdeI )表达载体pET-28a(+)时，双酶切产物纯化后未经T4 Ligase连接居然还能转化成功,是什么原因？酶切体系如下(25微升)：酶切缓冲液(1*K):2.5; pET28a(+):20; HindIII酶液:1; NdeI:1; 无菌超纯水:0.5. (2)载体自连的原理是什么？是载体经双酶切后剩余的部分连接还是双酶切中一个内切酶活性较低没有切开，切开的那端又重新连回原处？ (3)经单酶切的表达载体pET-28a(+)能转化至大肠杆菌体内吗？一定要是环状闭合共价的质粒(cccDNA)才能导入细胞吗？ (4)电转化前要对连接产物中的重组DNA进行洗涤沉淀，但连接产物体系为20微升，重组DNA无法用肉眼观察，如何在弃去上清的时候防止重组DNA也一并被弃去？ 求各位高手指教！不甚感激！ |
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cicelyzh
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4楼2013-04-23 16:50:14
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【答案】应助回帖
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酶切时，要注意DNA的量以及酶的用量。由于不同的酶的活性单位定义是不一样的，酶切时两种酶的用量通常也不一样。你的酶切体系中，用了20ul的DNA，你的质粒定量了（浓度知道吗？）？一般来说，一个简单的克隆，载体酶切时，用1---2ug的质粒就足够了，因为用回收的载体连接时，只需要50--100ng的酶切后的载体DNA就足够了。 太多的载体DNA可能导致质粒酶切不完全，就会出现你描述的情况1. 为了保证载体和PCR产物的完全酶切，我建议你用double digestion designer （http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/showresult.php）来设计你的双酶切，可以精确计算酶切所需的酶量，还能根据酶的供应商来推荐最合适的buffer，确保酶切完全，有效减少克隆时的背景克隆，从而提高克隆成功率。 祝好运！ |
5楼2013-04-23 22:07:24
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7楼2013-04-25 13:31:25
cicelyzh
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8楼2013-04-25 14:24:30
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【答案】应助回帖
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(1)双酶切( HindIII & NdeI )表达载体pET-28a(+)时，双酶切产物纯化后未经T4 Ligase连接居然还能转化成功,是什么原因？酶切体系如下(25微升)：酶切缓冲液(1*K):2.5; pET28a(+):20; HindIII酶液:1; NdeI:1; 无菌超纯水:0.5. 答：分子生物学实验中的酶切连接等试验都是概率事件，酶切后不能保证所有闭合环状质粒都能切开，只能说大部分切开，因而转化依然会有质粒存在，闭合环状的质粒只要少许进入感受态细胞即可大量繁殖，所以你遇到的情况正常，顺便说一句，没人像你这样酶切后还进行转化的。 (2)载体自连的原理是什么？是载体经双酶切后剩余的部分连接还是双酶切中一个内切酶活性较低没有切开，切开的那端又重新连回原处？ 答：正如上面所说，连接一个概率事件，也是个非特异性反应，互补配对的连接自然是最大概率事件，但是非互补配对连接也是少量存在的，连接酶的催化没有特意的靶向的的核苷酸序列，只是依靠分子间碰撞的概率，通过磷酸二酯键或者氢键进行链接和互补配对，从理论上来说，不会存在粘性末端和平末端或者非配对的粘性末端之间的连接的，你所遇到的自连事件，其实就是只有一个酶切开后的自连，另外一个酶就没有切开。 (3)经单酶切的表达载体pET-28a(+)能转化至大肠杆菌体内吗？一定要是环状闭合共价的质粒(cccDNA)才能导入细胞吗？ 答：是否能够转化进入感受态细胞，和DNA的形态没有太大关系，但是形态的确会影响转化效率，线性转化进入细胞的概率小于环状质粒，但是线性质粒进入感受态细胞是无法复制的，具体去查看教材，所以最终的质粒都是环状质粒。 (4)电转化前要对连接产物中的重组DNA进行洗涤沉淀，但连接产物体系为20微升，重组DNA无法用肉眼观察，如何在弃去上清的时候防止重组DNA也一并被弃去？ 答：我不知道你这一步是什么意思，连接后的重组子转化还需要用电转码？转化进入感受态细胞传统的热激方法就行了，如果进不去，就选用商品化的感受态细胞。 求各位高手指教！不甚感激！ |
9楼2013-04-25 21:30:20
cicelyzh
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