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酶切、连接和转化
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(1)双酶切( HindIII & NdeI )表达载体pET-28a(+)时，双酶切产物纯化后未经T4 Ligase连接居然还能转化成功,是什么原因？酶切体系如下(25微升)：酶切缓冲液(1*K):2.5; pET28a(+):20; HindIII酶液:1; NdeI:1; 无菌超纯水:0.5. (2)载体自连的原理是什么？是载体经双酶切后剩余的部分连接还是双酶切中一个内切酶活性较低没有切开，切开的那端又重新连回原处？ (3)经单酶切的表达载体pET-28a(+)能转化至大肠杆菌体内吗？一定要是环状闭合共价的质粒(cccDNA)才能导入细胞吗？ (4)电转化前要对连接产物中的重组DNA进行洗涤沉淀，但连接产物体系为20微升，重组DNA无法用肉眼观察，如何在弃去上清的时候防止重组DNA也一并被弃去？ 求各位高手指教！不甚感激！ |
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