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酿酒酵母的电转方法
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想请教一下酿酒酵母和毕赤酵母电转感受态的制备有什么区别吗？ 我们实验室只有酿酒酵母，可是我只找到了毕赤酵母感受态的制备方式，不知道能不能通用呢？ 一下是毕赤酵母感受态的制备方法： 1)在含 5mlYPD 的 50ml 离心管中，培养毕赤酵母，30 度过夜 2)取 0.1-0.5ml 过夜培养物，接种含 500ml 新鲜培养基的 2L 摇瓶，过夜生长至 OD600＝1.3-1.5 3)4 度，1500g离心 5min收集细胞，用 500ml预冷的灭菌水悬浮细胞 4)如上离心，用 250 ml预冷的灭菌水悬浮细胞 5)如上离心，用 20ml预冷的 1M山梨醇悬浮细胞 6)如上离心，用 1 ml 预冷的1M山梨醇悬浮细胞，至终体积约1.5ml 注意：可冻存80ul 等量的电感受态细胞，但转化效率会下降很多 小女子先谢谢各位大神了！！ |
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greenhope3371
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【答案】应助回帖
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qing1220(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-04-27 14:52:31
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qing1220(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-04-27 14:52:31
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我后期也计划采用毕赤酵母表达，个人觉得值得一试； 另外附上复旦大学一哥们学位论文中的一段描述，粘贴有个别字迹错误，最好自己下载原文参考； 《同源重组技术在酿酒酵母表达载体构建中的应用》 2004年 酵母LiAC转化法[421 接种酿酒酵母单菌落在3mLYEPD培养基中30。C，250rpm振荡培养过夜。 将过夜培养物稀释转接到50mLYEPD培养基中，使得细胞密度为5×106个／n1L。 30。C、250rpm培养5～7hr，使得细胞培养至2×107个／mL(细胞在此期叫繁殖两 代)，5，000rpm、5min离心收集菌体。弃上清，用20mL无菌水悬浮菌体。 5,000rpm、5rain离心收集菌体。弃上清，将菌体悬浮于10mL 0．1M LiAC中， 30。C水浴10rain。5，000rpm、5min离心收集菌体。弃上清，加入1 mL 0．IM LiAC， 混匀，使得细胞终浓度为1×109个／mL(此即为制备好的感受态细胞)。 吸取100I_tL 菌体到一个无菌Eppendorf管中，离心沉淀细胞，用微量移液器吸去LiAC。加 入下列转化混合物：2409L 50％PEG，361aL LiAC，101aL 10rag／mE ssDNA(临用 前应在沸水中煮5分钟，然后立即置于冰上以变性ssDNA)，10此转化DNA(转 化质粒DNA用量为0．5pg、重组转化DNA包括线形化载体片段llxg和目的基因 或目的基因表达单元PCR片段，PCR片段用量为载体片段摩尔比的6倍【261)， 补水至总体积为360pL。30℃水浴30min，42℃水浴20rain。10，000叩m，30s离 心，用微量移液器吸去上清，加100“L无菌水涂布选择性平板。30℃静置培养 2~3天。 |
3楼2013-03-26 14:57:26
4楼2014-03-29 09:23:17
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