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chaoen

木虫 (正式写手)

[求助] 酶蛋白自沉淀问题

由于实验室传统,所有Histag纯化的酶都是迅速冷冻后,在-80条件保存,一般都没有问题,酶当中有250 mM imidazole还有50mM左右磷酸盐和氯化钠。但今天准备测定几个酶的酶活,发现其中一个酶在化冻后,大概几个小时后,开始出现大量沉淀。在常温和冰上化冻都出现相同现象。刚化冻后的酶液检测是有活力的。
请教一下是否有朋友遇到类似问题,是不是因为imidazole的原因使酶变性了?或者还有可能是其他情况?多谢!
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wd_bio

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
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chaoen: 金币+1, ★★★很有帮助 2013-03-22 11:08:33
laozuzunzhe: 金币+3, good! 2013-03-22 14:32:34
新纯化的蛋白,暂时不急冻,看看是不是也会过几小时沉淀,假如是,那可能是蛋白聚合沉淀。可以在纯化中加少量温和变性剂试试。
2楼2013-03-22 10:48:09
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chaoen

木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by wd_bio at 2013-03-22 03:48:09
新纯化的蛋白,暂时不急冻,看看是不是也会过几小时沉淀,假如是,那可能是蛋白聚合沉淀。可以在纯化中加少量温和变性剂试试。

多谢回复。那你是不是觉得imidazole导致沉淀的可能性不大?另外,请问哪些温和变性剂可以用来防止蛋白聚合沉淀呢?
3楼2013-03-22 11:07:29
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wd_bio

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

温和的变性剂例如SDS,低浓度的尿素,或者低浓度Triton-X100都可以,但是判断哪个有效可能就要作预实验分析了。
4楼2013-03-22 11:55:29
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qqxs

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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应该不是咪唑的原因。估计是酶本身不稳定(如其保持结构需要特殊金属离子)
5楼2013-03-22 11:58:52
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我觉得SDS挺悬乎,得看酶,我的酶遇到5mM的SDS就不行了。
流星来时我许了个愿,愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具,久不看论坛一来就提问者,宁弃EPI和VIP也不回帖。
6楼2013-03-23 00:00:02
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