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2011210200

金虫 (小有名气)

[求助] 求各位帮忙分析一下PCR电泳图，maker也跑得不好，好伤心……

是土壤总DNA提取后，扩增16srDNA 某片段去做DGGE,PCR后的电泳图如下图，maker是2000bp的，最后条100bp怎么没有？80v，50min跑的跑成这样是啥原因啊？图上最后条应该是250bp，所需片段是250bp左右，好像扩增的效率不是很高啊，有引物二聚体，请各位大牛给点建议嘛，到底是哪里出错了？DNA模板稀释50倍后是300ng/ul左右，PCR体系里就是将模板稀释50倍后加了1ul。

以土壤总DNA为模板扩增16S rDNA序列内的部分片段(200bp左右).JPG



以土壤总DNA为模板扩增16S rDNA序列内的部分片段(200bp左右)2.JPG
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1楼 2013-03-14 21:48:28
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
2011210200: 金币+5, ★有帮助 2013-03-19 12:18:09
感觉你的胶没有溶好，可能有颗粒，或者是倒胶时候部分凝固了。从MARKER上可以看出来。
而且，可能你的退火温度太高了，感觉目的条带模糊一片。为什么跑胶跑那么长时间呢？我们一般这种叫就100V，12min就差不多了。
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2楼2013-03-15 15:06:54
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陈彦利

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by dshlove at 2013-03-15 15:06:54
感觉你的胶没有溶好，可能有颗粒，或者是倒胶时候部分凝固了。从MARKER上可以看出来。
而且，可能你的退火温度太高了，感觉目的条带模糊一片。为什么跑胶跑那么长时间呢？我们一般这种叫就100V，12min就差不多了。

你好，PCR扩增后出现两条带说明什么问题呀，求指教
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3楼2013-03-19 21:48:18
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当下的距离

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

漏胶了，重新点样，可能有颗粒，或者是倒胶时候部分凝固了。
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youcangetwhatyouwantifyouwantitenough.
4楼2013-03-20 00:37:12
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 陈彦利 at 2013-03-19 21:48:18
你好，PCR扩增后出现两条带说明什么问题呀，求指教...

可能你的退火温度太低了，引物有非特异性结合，P出来非特异性条带了。
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5楼2013-03-20 09:28:51
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陈彦利

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by dshlove at 2013-03-20 09:28:51
可能你的退火温度太低了，引物有非特异性结合，P出来非特异性条带了。...

明白！谢谢你！
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6楼2013-03-20 10:40:17
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陈彦利

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by dshlove at 2013-03-20 09:28:51
可能你的退火温度太低了，引物有非特异性结合，P出来非特异性条带了。...

两条带都跟模版链不一样，也是这个原因吗？
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7楼2013-03-20 11:25:24
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by 陈彦利 at 2013-03-20 11:25:24
两条带都跟模版链不一样，也是这个原因吗？...

我理解的非特异性条带是会比模板链长度要小的，引物可能在中间部位什么的结合了。而且结合位置不固定，导致P出来的条带不是清晰明亮的，就出现糊成一片的现象。
做一个温度梯度PCR试试。
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8楼2013-03-20 14:26:54
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2011210200

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by dshlove at 2013-03-20 14:26:54
我理解的非特异性条带是会比模板链长度要小的，引物可能在中间部位什么的结合了。而且结合位置不固定，导致P出来的条带不是清晰明亮的，就出现糊成一片的现象。
做一个温度梯度PCR试试。...

想问一下这位同学，是否可以通过引物查询自己需要的目标产物是多少bp？我看的那篇文献上并没有说明这种引物的目标产物大概是多少bp。
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9楼2013-03-20 18:30:54
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by 2011210200 at 2013-03-20 18:30:54
想问一下这位同学，是否可以通过引物查询自己需要的目标产物是多少bp？我看的那篇文献上并没有说明这种引物的目标产物大概是多少bp。...

引物通俗点说就是排头兵，你不可能只看排头兵就知道这队伍到底多长，同样不可以只通过引物查询自己需要的目标产物是多少bp。
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10楼2013-03-20 19:53:20
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