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hubei989

木虫 (正式写手)

酵父菌

[求助] 引物特异性验证

最近准备做荧光定量PCR。已经设计了引物，想请问下怎么验证引物的特异性哇？
用该引物进行PCR，然后对其产物进行测序比对可不可以呢？  万分感谢哇~
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迷惑不解~
1楼 2013-03-13 16:40:22
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soarrow

铁杆木虫 (正式写手)

酱油歪楼党

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+2, 鼓励应助！ 2013-03-14 15:21:36
hubei989: 金币+5, ★★★很有帮助, 现在正在做的就是你说的第一条，在做克隆测序。还有个问题，如果我只做理论验证不做实验验证，会不会不严谨啊？（样比较多，许多都是未知菌，不好选取同源性相近的菌）） 2013-03-14 15:23:42
1. 可以在NCBI上面进行Blast，看看有没有目的基因以外的高同源性序列，这是理论验证；
2. 实验验证就是拿引物去做特异性验证---拿检测目标的核酸以及与目标同源性相近的其它核酸进行实验验证。
补充楼上的，如果对产物进行测序验证---Realtime PCR产物一般都比较小，100bp左右，PCR产物基本没法直接送公司回收测序，这个得做克隆测序。
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3楼2013-03-14 12:52:36
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eagles123

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
hubei989: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢哈~担心副产物和目标产物大小差不多~ 2013-03-14 11:25:08
laozuzunzhe: 金币+3, 鼓励交流应助！ 2013-03-14 15:21:00
可以，都不一定要测序 PCR后跑胶如果只有单一条带 且大小和你的目标产物大小一样 基本就可以确认了。 当然 要保险起见 测序也行
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2楼2013-03-13 18:55:08
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