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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 从头设计引物克隆全长基因
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fengyunqb

新虫 (小有名气)

[求助] 从头设计引物克隆全长基因

我的序列是未知的，我先做了保守区克隆+3'race+5'race，然后将他们拼接起来，去掉属于质粒和RACE试剂盒的区段，得到拼接序列。我现在想从头设计引物来克隆这个序列。验证一下拼接结果。5'端引物打分还行，3'端结尾打分都比较低。并且还有个POLY A尾十几个A。有这方面经验的虫友指点我下，该怎么做呢。谢谢。
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1楼 2013-03-07 10:20:12
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niil

金虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by fengyunqb at 2013-03-08 09:18:17
可是，这是一个未知基因。ORF具体在哪我也不知道。难道用于测的ORF，但是怕这个不靠谱哇。...

只要你得到了全长cDNA，ORF是很好预测的。
NCBI有在线的预测工具ORF finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）
并且用blastx做一下比对，ORF是很容易确定的。
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Stop fighting,let it flow.
8楼2013-03-08 09:32:17
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niil

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
说实话，这样做没必要。片段经过片段重叠组装到一起，可信度是非常高的，除非你得到的片段重叠区较短。
要做验证的话，可以针对重叠区，在重叠区两端设计引物来验证下重叠区是否可靠。这比从头设计引物容易得多。
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2楼2013-03-07 10:50:05
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fengyunqb

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by niil at 2013-03-07 10:50:05
说实话，这样做没必要。片段经过片段重叠组装到一起，可信度是非常高的，除非你得到的片段重叠区较短。
要做验证的话，可以针对重叠区，在重叠区两端设计引物来验证下重叠区是否可靠。这比从头设计引物容易得多。

可是，我还要做表达，以及这个基因功能的研究。所以才准备做全长基因克隆的。
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3楼2013-03-07 11:40:05
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niil

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
fengyunqb: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-03-08 09:18:27
fengyunqb: 金币+10, ★★★★★最佳答案 2013-04-22 16:24:30
引用回帖:
3楼: Originally posted by fengyunqb at 2013-03-07 11:40:05
可是，我还要做表达，以及这个基因功能的研究。所以才准备做全长基因克隆的。...

那这样的话，在ORF两端设计引物，就是扩起始密码和终止密码之间的片段就行。
引物的位置不用严格限定位于这两个位点，能在ORF外侧设计引物最好，要是在ORF内侧设计引物，与起始密码和终止密码差个10-20bp没有问题，引物稍微长一点，把这个片段克隆出来之后，再进行表达载体构建，这时候把缺失的碱基通过引物设计的方法补上在以克隆出来的片段为模板获得完整的ORF。
引物设计软件的得分虽然是衡量标准，但是得分低并不是意味着这个片段扩不出来。尤其是定点设计引物的时候，有矛盾也只能退而求次了。
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4楼2013-03-07 12:02:45
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