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guyue900905

新虫 (初入文坛)

[求助] 什么样地结果算是pcr后p出来了，谢谢~~~~~

我提取的动物肌肉组织rna，od值略大，但是师姐说只要PCR能P出来就可以了。我想问一下各位高手，什么样算是P出来了啊？谢谢。顺便问一下普通pcr的条件和实时荧光定量pcr条件一样么？谢谢
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1楼 2013-03-05 10:15:57
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柠檬果果

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
首先，如果OD值偏大，PCR的时候有可能是扩的是基因组的片段，所以设计引物的时候最好是跨着内含子设计，这样估计就像你师姐说的，PCR能P出来就可以了；
其次，能P出来的就是说除了引物二聚体的条带外，你所扩增的目的片段的大小，跟你设计引物时的片段大小基本相同，不能太大也不能太小，否则很可能是非特异性扩增或者其他的情况，这种得到的片段一般都不是你想要的；
最后，实时荧光定量的条件一般是固定的，跟荧光定量的试剂有关，一般与普通PCR的条件是不一样的，荧光定量的条件在试剂说明书上都有，包括PCR的组分和各阶段的反应时间，基本按照那个上面的做就没有问题
做荧光定量的实验，最好是把RNA提的质量高一点，这样后期做也比较顺畅，其实不是很难，入门以后就简单了，好好做，加油！
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没有如果。。
2楼2013-03-05 11:03:56
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yesali

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
能扩增出目的条带就算P出来了
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3楼2013-03-05 12:08:22
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guyue900905

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 柠檬果果 at 2013-03-05 11:03:56
首先，如果OD值偏大，PCR的时候有可能是扩的是基因组的片段，所以设计引物的时候最好是跨着内含子设计，这样估计就像你师姐说的，PCR能P出来就可以了；
其次，能P出来的就是说除了引物二聚体的条带外，你所扩增的目 ...

谢谢啦  我觉得受益匪浅。我还想在问一下，我做荧光定量pcr的时候，看说明书写了反应时候的各个温度和时间。我就按它写的的那个条件设置就可以么？还是说我得自己摸索啊。非常感谢
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4楼2013-03-05 15:27:56
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guyue900905

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 柠檬果果 at 2013-03-05 11:03:56
首先，如果OD值偏大，PCR的时候有可能是扩的是基因组的片段，所以设计引物的时候最好是跨着内含子设计，这样估计就像你师姐说的，PCR能P出来就可以了；
其次，能P出来的就是说除了引物二聚体的条带外，你所扩增的目 ...

我还想在问一下做荧光定量的时候，标准曲线是怎么做的啊？
我可不可以先做实验最后再补上标准曲线啊？
我反转录出来的cDNA最长可以在负20摄氏度中放多长时间啊？
谢谢
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5楼2013-03-05 15:30:37
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柠檬果果

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by guyue900905 at 2013-03-05 15:27:56
谢谢啦  我觉得受益匪浅。我还想在问一下，我做荧光定量pcr的时候，看说明书写了反应时候的各个温度和时间。我就按它写的的那个条件设置就可以么？还是说我得自己摸索啊。非常感谢...

我们都是用的说明书上的条件，正常情况下都可以的，在做荧光定量之前，只要确保你的引物好用，能扩出想要的目的片段就好，然后按照说明书上的条件来做就可以了，一般都不用改的
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没有如果。。
6楼2013-03-07 23:19:02
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柠檬果果

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by guyue900905 at 2013-03-05 15:30:37
我还想在问一下做荧光定量的时候，标准曲线是怎么做的啊？
我可不可以先做实验最后再补上标准曲线啊？
我反转录出来的cDNA最长可以在负20摄氏度中放多长时间啊？
谢谢...

标准曲线都是先做的吧，不然你拿什么做对照，你怎么定出目的基因表达的量 啊？我没做绝对定量，我做的是相对的，只是比较动物个组织中表达的差异，并没有做出具体有多少量，我师姐用的标准曲线法做的。你用标准曲线法的话先做标准曲线吧，虽然麻烦点，不过结果需要。
我们一般都放-80度，可以放很久，不知道影不影响质量，反转录完了也没多久就用完了，一个月左右吧也就，-20度不太清楚，没放过
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没有如果。。
7楼2013-03-07 23:24:48
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