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guyue900905

新虫 (初入文坛)

[求助] 什么样地结果算是pcr后p出来了,谢谢~~~~~

我提取的动物肌肉组织rna,od值略大,但是师姐说只要PCR能P出来就可以了。我想问一下各位高手,什么样算是P出来了啊?谢谢。顺便问一下普通pcr的条件和实时荧光定量pcr条件一样么?谢谢
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guyue900905

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 柠檬果果 at 2013-03-05 11:03:56
首先,如果OD值偏大,PCR的时候有可能是扩的是基因组的片段,所以设计引物的时候最好是跨着内含子设计,这样估计就像你师姐说的,PCR能P出来就可以了;
其次,能P出来的就是说除了引物二聚体的条带外,你所扩增的目 ...

我还想在问一下做荧光定量的时候,标准曲线是怎么做的啊?
我可不可以先做实验最后再补上标准曲线啊?
我反转录出来的cDNA最长可以在负20摄氏度中放多长时间啊?
谢谢
5楼2013-03-05 15:30:37
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柠檬果果

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
首先,如果OD值偏大,PCR的时候有可能是扩的是基因组的片段,所以设计引物的时候最好是跨着内含子设计,这样估计就像你师姐说的,PCR能P出来就可以了;
其次,能P出来的就是说除了引物二聚体的条带外,你所扩增的目的片段的大小,跟你设计引物时的片段大小基本相同,不能太大也不能太小,否则很可能是非特异性扩增或者其他的情况,这种得到的片段一般都不是你想要的;
最后,实时荧光定量的条件一般是固定的,跟荧光定量的试剂有关,一般与普通PCR的条件是不一样的,荧光定量的条件在试剂说明书上都有,包括PCR的组分和各阶段的反应时间,基本按照那个上面的做就没有问题
做荧光定量的实验,最好是把RNA提的质量高一点,这样后期做也比较顺畅,其实不是很难,入门以后就简单了,好好做,加油!
没有如果。。
2楼2013-03-05 11:03:56
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yesali

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
能扩增出目的条带就算P出来了
3楼2013-03-05 12:08:22
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guyue900905

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 柠檬果果 at 2013-03-05 11:03:56
首先,如果OD值偏大,PCR的时候有可能是扩的是基因组的片段,所以设计引物的时候最好是跨着内含子设计,这样估计就像你师姐说的,PCR能P出来就可以了;
其次,能P出来的就是说除了引物二聚体的条带外,你所扩增的目 ...

谢谢啦  我觉得受益匪浅。我还想在问一下,我做荧光定量pcr的时候,看说明书写了反应时候的各个温度和时间。我就按它写的的那个条件设置就可以么?还是说我得自己摸索啊。非常感谢
4楼2013-03-05 15:27:56
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