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xmcxmyes

新虫 (小有名气)

[求助] 耐消毒剂基因PCR 急!在线等

样品1 梯度(51-62)2013-01-02 17hr 56min1.jpg(12.53KB)
http://kuai.xunlei.com/d/LnU4DabzQ53rUAQAfcc?p=130497

这个条带是258bp,我用50度的退火温度做,条带较浅,然后,做了个梯度扩增。51-62。发现上面第四泳道较好。即54度。便用54度继续扩增其他样品。但是结果却是下面这样。

前32个样2013-01-06 14hr 39min.jpg(13.78KB)
http://kuai.xunlei.com/d/LnU4DaTzHJ3rUAQAbb8?p=130497

我是分不解。不知道原因 ,其他的两个引物也是,只有在100bp处有较亮的不清晰的带,如图。我没有拍照。。谁能告诉我。怎么回事??
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xmcxmyes

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-08 13:39:17
你确定是引物退火温度的问题吗?PCR用的什么模板?用量多少?此外,做退火温度梯度的时候是否做了重复?一般的引物在很大温度范围都会有不错的扩增,如果普遍条带不亮有可能和模板序列有关。你所说的100bp处模糊的带 ...

我不知道啊。我重新做了 退火温度梯度。效果还挺好。但是结果却没有出来目的条带。 好着急
3楼2013-01-09 19:54:26
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你确定是引物退火温度的问题吗?PCR用的什么模板?用量多少?此外,做退火温度梯度的时候是否做了重复?一般的引物在很大温度范围都会有不错的扩增,如果普遍条带不亮有可能和模板序列有关。你所说的100bp处模糊的带是引物二聚体吗?
2楼2013-01-08 13:39:17
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by xmcxmyes at 2013-01-09 19:54:26
我不知道啊。我重新做了 退火温度梯度。效果还挺好。但是结果却没有出来目的条带。 好着急...

你是说做梯度的时候可以P出来,但上其它样品的时候不行?这样很奇怪。是不是样品的模板没提好?
4楼2013-01-10 06:57:04
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xmcxmyes

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-10 06:57:04
你是说做梯度的时候可以P出来,但上其它样品的时候不行?这样很奇怪。是不是样品的模板没提好?...

我觉得不会。 引物其他引物 都是可以做出来一些呀。。
5楼2013-01-10 10:14:06
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