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xmcxmyes

新虫 (小有名气)

[求助] 耐消毒剂基因PCR 急！在线等

样品1 梯度(51-62)2013-01-02 17hr 56min1.jpg(12.53KB)
http://kuai.xunlei.com/d/LnU4DabzQ53rUAQAfcc?p=130497

这个条带是258bp,我用50度的退火温度做，条带较浅，然后，做了个梯度扩增。51-62。发现上面第四泳道较好。即54度。便用54度继续扩增其他样品。但是结果却是下面这样。

前32个样2013-01-06 14hr 39min.jpg(13.78KB)
http://kuai.xunlei.com/d/LnU4DaTzHJ3rUAQAbb8?p=130497

我是分不解。不知道原因 ，其他的两个引物也是，只有在100bp处有较亮的不清晰的带，如图。我没有拍照。。谁能告诉我。怎么回事？？
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1楼 2013-01-08 12:15:48
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你确定是引物退火温度的问题吗？PCR用的什么模板？用量多少？此外，做退火温度梯度的时候是否做了重复？一般的引物在很大温度范围都会有不错的扩增，如果普遍条带不亮有可能和模板序列有关。你所说的100bp处模糊的带是引物二聚体吗？
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2楼2013-01-08 13:39:17
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xmcxmyes

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-08 13:39:17
你确定是引物退火温度的问题吗？PCR用的什么模板？用量多少？此外，做退火温度梯度的时候是否做了重复？一般的引物在很大温度范围都会有不错的扩增，如果普遍条带不亮有可能和模板序列有关。你所说的100bp处模糊的带 ...

我不知道啊。我重新做了 退火温度梯度。效果还挺好。但是结果却没有出来目的条带。 好着急
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3楼2013-01-09 19:54:26
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by xmcxmyes at 2013-01-09 19:54:26
我不知道啊。我重新做了 退火温度梯度。效果还挺好。但是结果却没有出来目的条带。 好着急...

你是说做梯度的时候可以P出来，但上其它样品的时候不行？这样很奇怪。是不是样品的模板没提好？
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4楼2013-01-10 06:57:04
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xmcxmyes

新虫 (小有名气)
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4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-10 06:57:04
你是说做梯度的时候可以P出来，但上其它样品的时候不行？这样很奇怪。是不是样品的模板没提好？...

我觉得不会。 引物其他引物 都是可以做出来一些呀。。
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5楼2013-01-10 10:14:06
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by xmcxmyes at 2013-01-10 10:14:06
我觉得不会。 引物其他引物 都是可以做出来一些呀。。...

这可不一定。因为一般提基因组DNA的方法得到的不会是完整的染色体，都是shear成几十Kb的片段。如果操作时机械力大的话，片段会更小。有时候你要P的DNA被破坏的更为严重的话就会出现有的引物可以P出来，有的引物却效果很差。
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6楼2013-01-10 10:53:50
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xmcxmyes

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-10 10:53:50
这可不一定。因为一般提基因组DNA的方法得到的不会是完整的染色体，都是shear成几十Kb的片段。如果操作时机械力大的话，片段会更小。有时候你要P的DNA被破坏的更为严重的话就会出现有的引物可以P出来，有的引物却效 ...

哦，我是用水煮法提取的。估计是DNA不完整。尤其是在扩质粒型基因的时候，有很多非特异扩增，您知道原因吗？
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7楼2014-02-24 02:53:29
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