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fanwq258

木虫 (正式写手)

[求助] PCR退火温度

PCR退火温度,试了50,55,60度,都没有扩增出来,怎么回事,接下来该怎么做啊?求大师指点。
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要么好好活,要么死,拒绝半死不活
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fanwq258

木虫 (正式写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by wangqi20092 at 2012-12-21 21:54:51
具体信息发过来,引物,片段长度 试剂体系等等

模版是mRNA反转录的cDNA,要扩增的片段1040bp,试剂是TAKARA的mix。20ul的体系中模版1ul,引物各0.8ul,mix 10ul。引物Tm值分别是64,57。
要么好好活,要么死,拒绝半死不活
9楼2012-12-21 22:16:59
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dongrh1981

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2012-12-21 13:49:49
fanwq258: 金币+1 2012-12-21 22:43:15
amisking: 回帖置顶 2012-12-22 19:41:26
fanwq258: 金币+1 2012-12-30 21:56:13
首先,确认你所用的试剂是哪些厂家的,有没有问题?
其次,你提取的核酸是否OK,浓度和纯度能不能达到PCR要求?
最后,在做PCR时,带一个阴性质控和一个阳性质控,用于判断你的PCR试剂和PCR条件是否有问题。
一般来说引物长度在24bp左右时,退火温度55度左右应该是可以做出来的,所以建议你多考虑下前面的准备工作是否OK。
最好是将你的实验试剂、实验条件进行详细描述,否则无法判断具体原因
呼吸的痛
2楼2012-12-21 11:41:58
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platanus

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
fanwq258: 金币+1 2012-12-21 22:06:59
fanwq258: 金币+1 2012-12-30 21:56:19
跑一个梯度PCR试试看,有些引物对退火温度还是比较敏感的,一两度之间差异很大的。
3楼2012-12-21 11:42:40
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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
fanwq258: 金币+1 2012-12-21 22:07:08
fanwq258: 金币+1 2012-12-30 21:56:24
樓上兩位說的都很好,結合到一起吧,touchdown挺好的,如果引物沒問題一般都能P出?怼R餀z查的時候注意GC含量,過大的話可以嘗試用特殊的LA酶
我会绕一个圈,走回到实验室
4楼2012-12-21 13:50:17
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