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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR退火温度
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fanwq258

木虫 (正式写手)

[求助] PCR退火温度

PCR退火温度，试了50，55，60度，都没有扩增出来，怎么回事，接下来该怎么做啊？求大师指点。
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要么好好活，要么死，拒绝半死不活
1楼 2012-12-21 11:21:43
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回帖置顶 ( 共有1个 )

dongrh1981

金虫 (正式写手)

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★ ★ ★
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kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2012-12-21 13:49:49
fanwq258: 金币+1 2012-12-21 22:43:15
amisking: 回帖置顶 2012-12-22 19:41:26
fanwq258: 金币+1 2012-12-30 21:56:13
首先，确认你所用的试剂是哪些厂家的，有没有问题？
其次，你提取的核酸是否OK，浓度和纯度能不能达到PCR要求？
最后，在做PCR时，带一个阴性质控和一个阳性质控，用于判断你的PCR试剂和PCR条件是否有问题。
一般来说引物长度在24bp左右时，退火温度55度左右应该是可以做出来的，所以建议你多考虑下前面的准备工作是否OK。
最好是将你的实验试剂、实验条件进行详细描述，否则无法判断具体原因
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呼吸的痛
2楼2012-12-21 11:41:58
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platanus

木虫 (著名写手)

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fanwq258: 金币+1 2012-12-21 22:06:59
fanwq258: 金币+1 2012-12-30 21:56:19
跑一个梯度PCR试试看，有些引物对退火温度还是比较敏感的，一两度之间差异很大的。
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3楼2012-12-21 11:42:40
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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)

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★ ★
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fanwq258: 金币+1 2012-12-21 22:07:08
fanwq258: 金币+1 2012-12-30 21:56:24
樓上兩位說的都很好，結合到一起吧，touchdown挺好的，如果引物沒問題一般都能P出?怼Ｒ餀z查的時候注意GC含量，過大的話可以嘗試用特殊的LA酶
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我会绕一个圈，走回到实验室
4楼2012-12-21 13:50:17
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tanxi125

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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fanwq258: 金币+1 2012-12-21 22:07:16
跑个内参看看，内参一般都会跑出来，如果跑出来起码确定体系和模板没问题
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什么都得靠自己！我现在深刻理解！
5楼2012-12-21 15:49:03
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czcpudai

铜虫 (正式写手)

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fanwq258: 金币+1 2012-12-21 22:07:22
不知道你扩增的片段是多大？要是超过1kb的话，建议使用好的酶，比如Primestar，我觉得你的PCR问题不是出现在退火温度上，引物你都做了梯度了还是没有，建议换好的高保真酶！
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6楼2012-12-21 16:36:40
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reallpf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
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fanwq258: 金币+1 2012-12-21 22:07:28
提高引物特异性，采用touch-down PCR。
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7楼2012-12-21 16:52:01
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wangqi20092

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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fanwq258: 金币+1 2012-12-21 22:07:35
具体信息发过来，引物，片段长度 试剂体系等等
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8楼2012-12-21 21:54:51
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fanwq258

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by wangqi20092 at 2012-12-21 21:54:51
具体信息发过来，引物，片段长度 试剂体系等等

模版是mRNA反转录的cDNA，要扩增的片段1040bp，试剂是TAKARA的mix。20ul的体系中模版1ul，引物各0.8ul，mix 10ul。引物Tm值分别是64，57。
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要么好好活，要么死，拒绝半死不活
9楼2012-12-21 22:16:59
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fanwq258

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by dongrh1981 at 2012-12-21 11:41:58
首先，确认你所用的试剂是哪些厂家的，有没有问题？
其次，你提取的核酸是否OK，浓度和纯度能不能达到PCR要求？
最后，在做PCR时，带一个阴性质控和一个阳性质控，用于判断你的PCR试剂和PCR条件是否有问题。
一般 ...

模版是mRNA反转录的cDNA，要扩增的片段1040bp，试剂是TAKARA的mix。20ul的体系中模版1ul，引物各0.8ul，mix 10ul。引物Tm值分别是64，57。
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要么好好活，要么死，拒绝半死不活
10楼2012-12-21 22:18:45
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