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fanwq258

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[求助] PCR退火温度

PCR退火温度，试了50，55，60度，都没有扩增出来，怎么回事，接下来该怎么做啊？求大师指点。

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要么好好活，要么死，拒绝半死不活

1楼 2012-12-21 11:21:43

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fanwq258

木虫 (正式写手)

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引用回帖:

2楼: Originally posted by dongrh1981 at 2012-12-21 11:41:58
首先，确认你所用的试剂是哪些厂家的，有没有问题？
其次，你提取的核酸是否OK，浓度和纯度能不能达到PCR要求？
最后，在做PCR时，带一个阴性质控和一个阳性质控，用于判断你的PCR试剂和PCR条件是否有问题。
一般 ...

模版是mRNA反转录的cDNA，要扩增的片段1040bp，试剂是TAKARA的mix。20ul的体系中模版1ul，引物各0.8ul，mix 10ul。引物Tm值分别是64，57。

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要么好好活，要么死，拒绝半死不活

10楼2012-12-21 22:18:45

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dongrh1981

金虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

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kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2012-12-21 13:49:49
fanwq258: 金币+1 2012-12-21 22:43:15
amisking: 回帖置顶 2012-12-22 19:41:26
fanwq258: 金币+1 2012-12-30 21:56:13

首先，确认你所用的试剂是哪些厂家的，有没有问题？
其次，你提取的核酸是否OK，浓度和纯度能不能达到PCR要求？
最后，在做PCR时，带一个阴性质控和一个阳性质控，用于判断你的PCR试剂和PCR条件是否有问题。
一般来说引物长度在24bp左右时，退火温度55度左右应该是可以做出来的，所以建议你多考虑下前面的准备工作是否OK。
最好是将你的实验试剂、实验条件进行详细描述，否则无法判断具体原因

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呼吸的痛

2楼2012-12-21 11:41:58

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