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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » Q-PCR 退火温度
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yanjiwuluo

新虫 (小有名气)

[求助] Q-PCR 退火温度

你们好，我想i问一下，我在做Q-PCR结果我的内参退火温度，与其他引物的温度差的很多近10度左右。这么怎么办呢。其实内参本身的FW与RV就相差8度。我是新手...多谢
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1楼 2012-12-16 12:05:40
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
重新设计引物，调整Tm值到一致。
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2楼2012-12-17 06:44:46
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stewart3261

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
yanjiwuluo: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-12-18 16:18:03
这个你就把你的内参引物和目的基因的引物同时跑，试一下能不能跑出就能确定能不能用了！一般内参的退火温度的可适范围很大！
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3楼2012-12-17 09:10:34
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yanjiwuluo

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by stewart3261 at 2012-12-17 09:10:34
这个你就把你的内参引物和目的基因的引物同时跑，试一下能不能跑出就能确定能不能用了！一般内参的退火温度的可适范围很大！

好，谢谢，那我先试一下，如有什么不懂我再咨询你吧
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4楼2012-12-17 20:02:59
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yanjiwuluo

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-17 06:44:46
重新设计引物，调整Tm值到一致。

嗯，我先探一下他们的真正退火温度，怎么感觉引物公司给的报告单上的温度那么不靠谱，可能是不是FW跟RV一起他们的退火温度就变了，谢谢你喽
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5楼2012-12-17 20:06:20
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
yanjiwuluo: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-12-18 16:19:07
引物的退火温度只和自身的序列有关。用不同方法计算的退火温度会有些不一样。可能合成引物公司用的和你做设计的软件所用的方法不同。不管怎么样5'和3'的引物之间要差不多吧。
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6楼2012-12-18 07:33:27
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stewart3261

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by yanjiwuluo at 2012-12-17 20:02:59
好，谢谢，那我先试一下，如有什么不懂我再咨询你吧...

好的！我们做过内参的梯度55-65之间都能得到很好的扩增和熔解曲线！
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7楼2012-12-18 09:14:36
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