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chenzhu198

铁杆木虫 (著名写手)

[交流] 大家来说说做southern blot时，基因组DNA的提取方法

做southern blot，对基因组DNA质量要求很高...希望大家一起交流下...我现在用CTAB法提取出来的DNA的质量还行，就是到酶切的时候基本都要切上24小时以上...希望大家多提意见！谢谢！
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1楼2012-10-30 22:49:00
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rfengyi

禁虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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3楼2012-10-31 16:48:13
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chenzhu198

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by rfengyi at 2012-10-31 16:48:13
偶的还要48h，而且还没酶切完全，都不知道是什么原因，吸一点跑胶检测都没基因组的带了，可是全部点上去跑完发现还有，都不知道怎么办了

那你用的是什么方法提的基因组啊？？
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4楼2012-11-03 13:06:19
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
可以用试剂盒提一下，多次加酶
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5楼2012-11-03 13:39:57
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shucanwei

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
chenzhu198: 金币+1 2012-11-04 10:12:29
我用sds提，完整性很好，我酶切过夜就很弥散。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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6楼2012-11-03 19:14:01
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380846776

捐助贵宾 (文坛精英)
引用回帖:
3楼: Originally posted by rfengyi at 2012-10-31 16:48:13
偶的还要48h，而且还没酶切完全，都不知道是什么原因，吸一点跑胶检测都没基因组的带了，可是全部点上去跑完发现还有，都不知道怎么办了

这个回复不错哦
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8楼2012-11-03 20:54:25
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380846776

捐助贵宾 (文坛精英)
用sds提，完整性
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9楼2012-11-03 20:54:47
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chenzhu198

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by shucanwei at 2012-11-03 19:14:01
我用sds提，完整性很好，我酶切过夜就很弥散。

SDS 你们用的是哪种的啊？能给我一份操作步骤么
我现在是各种方法都试.....谢谢！
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10楼2012-11-04 10:14:06
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chenzhu198

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 380846776 at 2012-11-03 20:54:47
用sds提，完整性

啊啊？你化学工程的啊....我以前也是的...
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11楼2012-11-04 10:14:34
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shucanwei

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
10楼: Originally posted by chenzhu198 at 2012-11-04 10:14:06
SDS 你们用的是哪种的啊？能给我一份操作步骤么
我现在是各种方法都试.....谢谢！...

可以，我看晚上发给你，现在是用手机上网，没有资料。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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12楼2012-11-04 13:15:03
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shucanwei

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
chenzhu198: 金币+5 2012-11-05 07:52:40
小丹木木: 金币+5, 鼓励交流 2012-11-06 17:28:25
DNA抽提缓冲液（lysis buffer）：50mM Tris-Hcl（Ph7.2）
                             50mM EDTA
                             3% SDS
                             1% β-巯基乙醇（用时加）
饱和酚：氯仿（V：V,1：1）
异丙醇
3M醋酸钠NaOAc（Ph8.0）

1．        称取0.075－0.085g干菌丝置于预冷的研钵中，加入液氮研磨至细粉末状，迅速转至1.5ml的离心管中并加入750μl DNA提取缓冲液（65℃预热），在振荡器上振荡几秒钟充分混匀，然后放到65℃水浴锅中水浴60min，每10min摇动一次。
2．        加入750μl饱和酚：氯仿（V：V,1：1）轻轻颠倒离心管数次充分混匀，室温下12000rpm离心15min，取上清液置于新的离心管中。
3．        加入1/30体积的3M醋酸钠NaOAc（PH8.0）和0.54体积的异丙醇，轻轻混匀后置于4℃冰箱中30min，室温下12000rpm离心2min，小心倒掉上清液，然后用冷的70％乙醇洗涤沉淀两次（轻轻颠倒离心管若干次），倒掉乙醇。
4．        将装有DNA沉淀的离心管置于真空干燥器中，干燥约30min（时间以DNA变干为准）。
5．        加入500μl的ddH2O溶解DNA沉淀，同时加入1－2μl RNase（终浓度为20μg/ml）,37水浴60min。
6．        加入等体积的饱和酚：氯仿（V：V,1：1），充分混匀，然后室温下12000rpm离心15min，取上清液置于新的离心管中。
7．        重复步骤3。
8．        重复步骤4。
9．        加入100ml TE溶解DNA，待完全溶解后置于－20℃冰箱中备用。
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13楼2012-11-04 15:46:14
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chenzhu198

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by shucanwei at 2012-11-04 15:46:14
DNA抽提缓冲液（lysis buffer）：50mM Tris-Hcl（Ph7.2）
                             50mM EDTA
                             3% SDS
                             1% β-巯基乙醇（用时加）
饱和酚：氯仿 ...

你提的是菌丝的？
但是这个办法我可以试一下...以前没有用SDS的试过！谢谢！
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14楼2012-11-05 07:54:09
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rfengyi

禁虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
chenzhu198: 金币+5 2012-11-05 20:30:48
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-11-06 17:28:34
本帖内容被屏蔽
15楼2012-11-05 14:53:04
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chenzhu198

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by rfengyi at 2012-11-05 14:53:04
我没有用SDS提，用的是CTAB，水浴1h后先用Tris饱和酚抽一次，再用氯仿抽一次，抽完要上清分步加RNaseA Proteinase K，然后再一次酚，一次氯仿，最后异丙醇沉淀。不过沉淀出来的DNA是白色的。...

我也用的是ctab，但是我没有用过蛋白酶K，你提的DNA是做southern的么？提取出来的DNA的酶切怎样？我现在做的是植物的！
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16楼2012-11-05 20:32:36
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rfengyi

禁虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
17楼2012-11-06 09:10:52
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chenzhu198

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by rfengyi at 2012-11-06 09:10:52
就跟第一个回帖说的那样，点小量酶切样品跑胶以为都切完全了，可是最后全点上去跑，又能看到一条很弱的基因组的带，实际上也没完全切开。现在打算把酶切体系做大一点试试。...

我切得也是这样...我用五百的体系切的话也这样
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18楼2012-11-06 12:22:41
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dxzhaomiao

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我以前做转基因烟草southern，用的SDS法，基因组提出来挺好的，酶切也很好，但是southern做不出来，做了十几次一直没做出来。你做的是什么植物的？
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19楼2012-11-06 14:21:21
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dxzhaomiao

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
chenzhu198: 金币+1 2012-11-06 16:44:44
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-11-06 17:28:46
SDS法原理步骤都差不多，我的方法跟13楼的好像大差不差，但是细节处有不一样的，比如要用50ml离心管，异丙醇沉淀的时候要过滤，还有做southern用的基因组不能加醋酸钠，太具体就记不清了。如果楼主需要，等我下班整理下给你
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20楼2012-11-06 14:26:43
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chenzhu198

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
20楼: Originally posted by dxzhaomiao at 2012-11-06 14:26:43
SDS法原理步骤都差不多，我的方法跟13楼的好像大差不差，但是细节处有不一样的，比如要用50ml离心管，异丙醇沉淀的时候要过滤，还有做southern用的基因组不能加醋酸钠，太具体就记不清了。如果楼主需要，等我下班整 ...

好的！非常的感谢！
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21楼2012-11-06 16:45:21
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chenzhu198

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
19楼: Originally posted by dxzhaomiao at 2012-11-06 14:21:21
我以前做转基因烟草southern，用的SDS法，基因组提出来挺好的，酶切也很好，但是southern做不出来，做了十几次一直没做出来。你做的是什么植物的？

我做的是小麦的...也做了十几次了...有带但是都在同一位置上，怀疑是非特异带..而且酶切的都不是很充分！
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22楼2012-11-06 16:46:40
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czcpudai

铜虫 (正式写手)
★
chenzhu198: 金币+1 2012-11-06 19:14:14
可以使用试剂盒提取  或者是试剂也可以  想英俊等公司都有买的，国内的好多生物公司也有，其实质量也可以
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24楼2012-11-06 17:03:50
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chenzhu198

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
24楼: Originally posted by czcpudai at 2012-11-06 17:03:50
可以使用试剂盒提取  或者是试剂也可以  想英俊等公司都有买的，国内的好多生物公司也有，其实质量也可以

试剂盒我用过一次，后感觉提的量上不去就没用了....我想可以再试试！
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25楼2012-11-06 19:15:22
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rfengyi

禁虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
chenzhu198: 金币+5 2012-11-08 13:32:55
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验 2012-11-08 13:56:32
本帖内容被屏蔽
28楼2012-11-08 11:37:06
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chenzhu198

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
28楼: Originally posted by rfengyi at 2012-11-08 11:37:06
我也这样提过植物的基因组，不过植物的基因组最后多洗几次，DNA沉淀相对比较透明，测浓度时OD260/280的值1.9左右， 0D260/230的值1.6左右，做酶切时大概两天就能切完全；可是真菌的基因组DNA测的0D260/230才1.1左右 ...

嗯嗯！你说的这个很对啊！我每次提的0D260/230都在1.6几。可能这是一个原因...这个是不是杂质太多的原因二导致的酶切切不开啊...
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29楼2012-11-08 13:34:30
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rfengyi

禁虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
30楼2012-11-09 09:11:12
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chenzhu198

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
30楼: Originally posted by rfengyi at 2012-11-09 09:11:12
貌似OD230是测盐浓度、EDTA、有机溶剂的，用TE溶一般都会偏低，可是我用纯水溶的，测出来的值也这么低，酒精都洗好几遍了，可是实验还得做，就没管了，要切多久就切多久了，=。就是觉得有点浪费时间。...

是的！我每次用水和TE溶的也都较低，后来还是继续做，有的都切了快三天了，实在是等不了了，就直接做了，后发现还是没切完全，我做的时候每次都能出现条带都基本在同一个位置上，后来我分析还是DNA切得不完全和非特异的条带....但是发现切得时间太长了就会切碎了把DNA，现在只能在提DNA上看看了...
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31楼2012-11-09 11:29:10
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surgeon_CoA

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我做微生物的，用的天根的试剂盒，这样可以吗？
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32楼2013-05-03 22:40:20
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wangxin320

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
chenzhu198: 金币+5 2013-05-05 13:02:48
我用的SDS，EDTA，Tris裂解的，然后用酚氯仿进行抽提，提出来效果很好，我100ug的基因组酶切过夜都可以切成弥散
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33楼2013-05-04 18:15:41
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chenzhu198

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
33楼: Originally posted by wangxin320 at 2013-05-04 18:15:41
我用的SDS，EDTA，Tris裂解的，然后用酚氯仿进行抽提，提出来效果很好，我100ug的基因组酶切过夜都可以切成弥散

你好，能给我发一份你们那提DNA的步骤和试剂的配方吗？我这边提的基因组DNA感觉也还可以，就是用了很多酶都切不开，选了个识别四个碱基的酶就切的都是很小的条带！...
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34楼2013-05-05 13:02:41
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chenzhu198

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
32楼: Originally posted by surgeon_CoA at 2013-05-03 22:40:20
我做微生物的，用的天根的试剂盒，这样可以吗？

这个我不是很清楚，我只做过植物的，是不是微生物的和植物的还有区别的啊？
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35楼2013-05-05 13:03:59
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wangxin320

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
34楼: Originally posted by chenzhu198 at 2013-05-05 13:02:41
你好，能给我发一份你们那提DNA的步骤和试剂的配方吗？我这边提的基因组DNA感觉也还可以，就是用了很多酶都切不开，选了个识别四个碱基的酶就切的都是很小的条带！......

10mM Tris-Cl （pH 8.0），100mM EDTA，0.5%SDS
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36楼2013-05-05 22:01:45
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wangxin320

银虫 (小有名气)
引用回帖:
34楼: Originally posted by chenzhu198 at 2013-05-05 13:02:41
你好，能给我发一份你们那提DNA的步骤和试剂的配方吗？我这边提的基因组DNA感觉也还可以，就是用了很多酶都切不开，选了个识别四个碱基的酶就切的都是很小的条带！......

我提的是昆虫的基因组，不知道你是提什么样品的，但愿能对你有帮助
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37楼2013-05-05 22:02:35
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chenzhu198

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
36楼: Originally posted by wangxin320 at 2013-05-05 22:01:45
10mM Tris-Cl （pH 8.0），100mM EDTA，0.5%SDS...

好的谢谢！
我提的是小麦的！试试先
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38楼2013-05-06 08:03:53
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xixicau

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你好，请问你最后问题怎么解决的？
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39楼2014-08-27 09:56:03
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请你爱上笑

新虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
chenzhu198: 金币+10 2014-12-01 11:13:03
实验是需要多次重复的，楼主多try try! 从精神上鼓励楼主
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40楼2014-12-01 11:12:03
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简单回复
pinestone2楼
2012-10-30 23:35   回复  
15581731427楼
2012-11-03 20:43   回复  
钕铁硼23楼
2012-11-06 16:49   回复  
xbsdhxy26楼
2012-11-06 19:46   回复  
chenzhu19827楼
2012-11-07 22:24   回复  
引用回帖:
26楼: Originally posted by xbsdhxy at 2012-11-06 19:46:09

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