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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大家来说说做southern blot时，基因组DNA的提取方法
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chenzhu198

铁杆木虫 (著名写手)

[交流] 大家来说说做southern blot时，基因组DNA的提取方法

做southern blot，对基因组DNA质量要求很高...希望大家一起交流下...我现在用CTAB法提取出来的DNA的质量还行，就是到酶切的时候基本都要切上24小时以上...希望大家多提意见！谢谢！
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1楼 2012-10-30 22:49:00
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shucanwei

木虫 (正式写手)
★ ★
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chenzhu198: 金币+1 2012-11-04 10:12:29
我用sds提，完整性很好，我酶切过夜就很弥散。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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6楼2012-11-03 19:14:01
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shucanwei

木虫 (正式写手)
★
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引用回帖:
10楼: Originally posted by chenzhu198 at 2012-11-04 10:14:06
SDS 你们用的是哪种的啊？能给我一份操作步骤么
我现在是各种方法都试.....谢谢！...

可以，我看晚上发给你，现在是用手机上网，没有资料。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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12楼2012-11-04 13:15:03
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shucanwei

木虫 (正式写手)
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chenzhu198: 金币+5 2012-11-05 07:52:40
小丹木木: 金币+5, 鼓励交流 2012-11-06 17:28:25
DNA抽提缓冲液（lysis buffer）：50mM Tris-Hcl（Ph7.2）
                             50mM EDTA
                             3% SDS
                             1% β-巯基乙醇（用时加）
饱和酚：氯仿（V：V,1：1）
异丙醇
3M醋酸钠NaOAc（Ph8.0）

1．        称取0.075－0.085g干菌丝置于预冷的研钵中，加入液氮研磨至细粉末状，迅速转至1.5ml的离心管中并加入750μl DNA提取缓冲液（65℃预热），在振荡器上振荡几秒钟充分混匀，然后放到65℃水浴锅中水浴60min，每10min摇动一次。
2．        加入750μl饱和酚：氯仿（V：V,1：1）轻轻颠倒离心管数次充分混匀，室温下12000rpm离心15min，取上清液置于新的离心管中。
3．        加入1/30体积的3M醋酸钠NaOAc（PH8.0）和0.54体积的异丙醇，轻轻混匀后置于4℃冰箱中30min，室温下12000rpm离心2min，小心倒掉上清液，然后用冷的70％乙醇洗涤沉淀两次（轻轻颠倒离心管若干次），倒掉乙醇。
4．        将装有DNA沉淀的离心管置于真空干燥器中，干燥约30min（时间以DNA变干为准）。
5．        加入500μl的ddH2O溶解DNA沉淀，同时加入1－2μl RNase（终浓度为20μg/ml）,37水浴60min。
6．        加入等体积的饱和酚：氯仿（V：V,1：1），充分混匀，然后室温下12000rpm离心15min，取上清液置于新的离心管中。
7．        重复步骤3。
8．        重复步骤4。
9．        加入100ml TE溶解DNA，待完全溶解后置于－20℃冰箱中备用。
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13楼2012-11-04 15:46:14
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