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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 阳性克隆的筛选问题
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xuyan_1215

新虫 (小有名气)

[求助] 阳性克隆的筛选问题

请教各位虫友，最近我在做连接，在转化之后挑取平板上的单菌落进行菌落pcr，结果显示为阳性的克隆却在双酶切的时候没有目的片段，而且测序也没有信号。请问这是怎么回事呢？用什么方法检验阳性克隆比较科学呢？（注：菌落pcr时阴阳性对照都设置了，阴性没P出来，阳性P出来的条带比菌落亮）

[ Last edited by xuyan_1215 on 2012-9-19 at 17:15 ]
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1楼 2012-09-19 17:11:12
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无疆@行者

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
菌液PCR快速，简单，通量大，但是有假阳性率，一般就是菌液PCR后，酶切鉴定，然后测序，如果经费充足，或者节省时间的话，就是菌液PCR，然后直接测序。一般测序结果是判断标准
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2楼2012-09-19 18:17:10
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xuyan_1215

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 无疆@行者 at 2012-09-19 18:17:10
菌液PCR快速，简单，通量大，但是有假阳性率，一般就是菌液PCR后，酶切鉴定，然后测序，如果经费充足，或者节省时间的话，就是菌液PCR，然后直接测序。一般测序结果是判断标准

我也是这样做的，每次做完菌液pcr就送样测序，但是结果总是无信号，这假阳性的概率也太大了。。。
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3楼2012-09-20 07:09:31
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lidonghong

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xuyan_1215: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-09-20 14:41:19
菌落PCR只能初步的判断下是否连接转化成功，但是假阳性率是非常高的，原因是因为裂解液残留的问题，你可以把你挑的几个阳性克隆进行扩大培养，然后提取质粒做质粒PCR和质粒酶切，这样就能确保没问题。
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生物化学与分子生物学
4楼2012-09-20 08:03:45
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xuyan_1215

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lidonghong at 2012-09-20 08:03:45
菌落PCR只能初步的判断下是否连接转化成功，但是假阳性率是非常高的，原因是因为裂解液残留的问题，你可以把你挑的几个阳性克隆进行扩大培养，然后提取质粒做质粒PCR和质粒酶切，这样就能确保没问题。

这样的思路也想过，但是我一般挑16个菌落进行pcr，每次都能出现10个以上的阳性克隆，那要是逐个挑取提质粒，工作量相当大呀，你一般是怎么做的？
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5楼2012-09-20 09:51:55
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reallpf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xuyan_1215: 金币+3 2012-09-20 14:41:36
引用回帖:
5楼: Originally posted by xuyan_1215 at 2012-09-20 09:51:55
这样的思路也想过，但是我一般挑16个菌落进行pcr，每次都能出现10个以上的阳性克隆，那要是逐个挑取提质粒，工作量相当大呀，你一般是怎么做的？...

工作量相当大？
一般转化后要结合几个方面确认后再送出测序：
菌落PCR：可以使用目的片段引物，载体引物，以及2者搭配鉴定。
选阳性克隆培养提质粒，PCR再鉴定。
酶切鉴定。
以上都正确才会送出测序。这些过程都可以在1天内完成，算不上工作量大吧。直接送出测序不仅浪费时间，如果错了回来还得重来，得不偿失。
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6楼2012-09-20 10:20:31
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无疆@行者

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
xuyan_1215: 金币+2, ★有帮助 2012-09-20 14:41:45
引用回帖:
3楼: Originally posted by xuyan_1215 at 2012-09-20 07:09:31
我也是这样做的，每次做完菌液pcr就送样测序，但是结果总是无信号，这假阳性的概率也太大了。。。...

那你得调整下连接，转化体系了。
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7楼2012-09-20 12:40:45
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lidonghong

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by xuyan_1215 at 2012-09-20 09:51:55
这样的思路也想过，但是我一般挑16个菌落进行pcr，每次都能出现10个以上的阳性克隆，那要是逐个挑取提质粒，工作量相当大呀，你一般是怎么做的？...

嗯 你要是觉得工作量大的话 就可以从你的菌落PCR阳性结果中，选取3到4个条带特别亮的菌落来进行扩大培养和进一步的鉴定！
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生物化学与分子生物学
8楼2012-09-20 17:13:44
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xuyan_1215

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by lidonghong at 2012-09-20 17:13:44
嗯 你要是觉得工作量大的话 就可以从你的菌落PCR阳性结果中，选取3到4个条带特别亮的菌落来进行扩大培养和进一步的鉴定！...

嗯，好的，不妨这样做做看。。。谢谢！！
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9楼2012-09-20 18:45:43
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lidonghong

金虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by xuyan_1215 at 2012-09-20 18:45:43
嗯，好的，不妨这样做做看。。。谢谢！！...

不用谢！客气
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生物化学与分子生物学
10楼2012-09-21 10:03:21
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